王宝剑[1]（2021）在《基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立》文中研究表明黄韧带肥厚（Ligamentum flavum hypertrophy,LFH）是退行性腰椎管狭窄症（Degenerative Lumbar Spinal Stenosis,DLSS）的主要病理表现之一。黄韧带（ligamentum flavum,LF）位于上、下椎板之间,从颈椎延伸至骶椎,起到保护和稳定脊柱的作用。黄韧带在纤维化过程中一方面是其自身体积发生增厚的改变,另一方面是其自身弹性的下降在脊柱后伸时出现皱褶、折叠,使椎管容积减小,导致马尾神经、神经根的受压和缺血缺氧。与此同时,肥厚黄韧带中增多的炎性介质会透过硬脊膜而扩撒至神经根,易造成神经根的炎症及水肿。另外,炎性介质还可以激活多种纤维化因子的表达而加速纤维化的进程。因此黄韧带炎症与纤维化的病理改变共同参与、相互影响而导致了 DLSS腰腿痛、间歇性跛行的症状。在退行性脊柱疾病的促炎细胞因子中,IL-1β、TNF-α是最主要的参与者,其在肥厚黄韧带中的高表达已得到初步证实,另外TGF-β 1/Smads被认为是引起纤维化的最重要的信号传导通路,它在各种组织与器官的纤维化和瘢痕组织纤维性修复过程中有着核心的推动作用。但目前关于黄韧带炎性或纤维化信号通路的研究较少。至于Smads通路是否可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带的肥厚,以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路中的相关原件与黄韧带厚度、纤维化程度的具体相关性尚未见报道。而在中医机制方面,“阳化气,阴成形”理论对黄韧带肥厚的病机阐明具有重要指导作用,该理论与现代医学“炎症-纤维化”的病理机制相契合。但目前尚无从该角度探讨黄韧带肥厚的报道。黄韧带肥厚动物模型的建立是研究退行性脊柱疾病的基础,也是探索黄韧带增厚机制、发现药物潜在治疗靶点的前提。但极少数研究涉及腰椎黄韧带肥厚动物模型的制作,对于该动物模型目前仍存在争议。实验一基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性目的:通过对比增厚黄韧带与未增厚黄韧带的纤维化程度以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路相关原件的表达水平,探索黄韧带厚度与纤维化程度和以上原件表达的具体相关性,初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。从“阳化气,阴成形”理论角度阐述黄韧带肥厚的中医病机,以期为中医药干预黄韧带“炎症-纤维化”病理过程提供理论支持。方法:（1）在取得医学伦理批准和患者知情同意的前提下,在临床手术中收集废弃的DLSS组增厚黄韧带和腰椎间盘突出症（Lumbar disc herniation,LDH）组未增厚黄韧带,各25例。（2）通过MRI测量两组黄韧带的厚度并对比其差异。（3）对两组标本组织进行HE染色组织学观察。（4）进行Masson三色法染色后,通过纤维化分级标准以及弹性纤维-胶原纤维比值来对比两组黄韧带总体与各层（腹侧层、中间层、背侧层）纤维化程度的差异。（5）免疫组化法检测两组黄韧带IL-1β、TNF-α、TGF-β 1/Smads（TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7）、collagen Ⅰ（Col 1）、collagen Ⅲ（Col 3）的定位、半定量表达。（6）Real-Time PCR 法检测两组黄韧带 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads（TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7）、Col1 和 Col 3 mRNA 的定量表达。（7）相关性研究:通过pearson相关与线性回归分析明确DLSS组黄韧带的厚度与其各层纤维化程度、mRNA表达的具体相关性。结果:（1）DLSS 组的黄韧带厚度为 5.13±0.80mm,大于 LDH 组 3.52±0.67mm（p<0.01）。（2）HE染色下,LDH组的未增厚黄韧带弹性纤维呈直线状,排列紧密且整齐,表面光滑连续,以弹性纤维为主,含有少量胶原纤维,细胞数目较少。DLSS组增厚的黄韧带纤维呈波浪状,排列紊乱、疏松,弹性纤维减少,胶原纤维含量增加,成纤维细胞增多。（3）DLSS组的总体纤维化分级为2.44±0.31级,高于LDH组的1.62±0.22级（p<0.05）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级是逐渐递增的,即腹侧层<中间层<背侧层（p<0.05或p<0.01）;DLSS组的弹性纤维-胶原纤维面积比值为1.85±0.54,低于LDH组的2.92±0.37（p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值均低于LDH组（p<0.05或p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值是逐渐递减的,即腹侧层>中间层>背侧层（p<0.05或p<0.01）。（4）免疫组化:DLSS 组的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-Smad2/3、Col 1和Col 3的蛋白表达均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）。DLSS组的Smad7的蛋白表达低于LDH组（p<0.01）。（5）Real-Time PCR:DLSS 组 IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1 和 Col 3 的 mRNA 表达高于 LDH 组（p<0.05 或 p<0.01 或 p<0.001）。DLSS 组 Smad7 的 mRNA 表达低于 LDH 组（p<0.05）;DLSS 组的 IL-1β、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3的mRNA表达在背侧层最高,腹侧层最低,有从背侧层向腹侧层逐渐递减的趋势。Smad7的mRNA表达在背侧层最低,腹侧层最高,有从背侧层向腹侧层逐渐递增的趋势。（6）在DLSS组中,黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的纤维化分级随着黄韧带的厚度的增加而升高。各层的相关系数r分别为0.54,0.73,0.84,说明黄韧带的厚度与背侧层纤维化分级的相关程度最高。黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的弹性纤维-胶原纤维比随着黄韧带的厚度的增加而降低。各层的相关系数r分别为-0.62,-0.72,-0.81,说明黄韧带的厚度与背侧层弹性-胶原纤维比值的相关程度最高。（7）在DLSS组中,黄韧带厚度与背侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为IL-1 β、Col 1等;黄韧带厚度与中间层IL-1 β mRNA表达的相关程度最高,其次依次为Smad7、TGF-β 1等;黄韧带厚度与腹侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为为IL-1 β、Col 3等。结论:（1）相较于未增厚黄韧带,肥厚黄韧带中TGF-β1、Smad2、Smad3（或p-Smad2/3）、Col 1和Col3的mRNA和蛋白均呈高表达,Smad7的mRNA和蛋白呈低表达。初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。（2）在肥厚黄韧带中,背侧层的纤维化程度大于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的纤维化程度呈正线性相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。在肥厚黄韧带中,IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3 mRNA表达均高于中间层和腹侧层,Smad7 mRNA表达低于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的mRNA表达呈正线性（或负线性）相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。说明黄韧带炎症与纤维化的严重程度由背侧向腹侧逐渐递减,其病理改变可由背侧向腹侧逐渐发展。（3）结合“阳化气,阴成形”理论认为,黄韧带在增龄、急性创伤、慢性劳损等因素作用下易出现微损伤,并诱导了局部炎症反应,当机体处于“阴平阳秘”的生理状态时,这种损伤尚能引发适度的炎症反应,以及正常的纤维化修复和瘢痕的形成,而当机体处于阴阳失衡、阳不化气状态时,持续的炎症反应使细胞因子、趋化因子等代谢产物长期聚集于黄韧带局部,形成了炎症微环境,从而诱发了过度的纤维化修复和瘢痕的形成。该中医理论与现代医学中炎症反应诱发过度的纤维化修复和瘢痕形成的理论相类似。实验二基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价目的:建立一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,并将其与人肥厚黄韧带组织进行比较、评估。同时,探讨腰椎活动范围的增加所诱发黄韧带增厚的机制。方法:（1）将72只大鼠分为A假手术组（切开皮肤等组织后缝合）、B肌肉切除组（切除L5-L6椎旁肌肉）、C骨关节切除组（切除L5-L6棘突和棘上韧带,磨除L5/6双侧关节突关节的一半,关节囊不做缝合处理）以及D肌肉+骨关节切除组（B+C混合）共4组,于造模后的4w、8w、12w共3个时间点取材。（2）通过对黄韧带的HE染色和Masson染色,测量L5/6节段黄韧带总体和背侧层的厚度以及弹性纤维-胶原纤维的比值。（3）通过X线片测量屈曲和背伸位时L5/6节段的活动范围和椎间隙高度。（4）通过免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR法检测黄韧带中炎性因子(IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads通路相关原件和Col 1、Col 3的表达。（5）将大鼠黄韧带与人肥厚黄韧带的退变程度进行比较、评估。结果:（1）HE染色与黄韧带厚度的测量:三种造模方法均可以引起黄韧带厚度的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的整体厚度是假手术组的1.35倍,骨关节切除组是假手术组的1.14倍,肌肉切除组是假手术组的1.06倍。但三种造模方法均不能引起黄韧带宽度的额外增加。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带背侧层厚度是假手术组的2.09倍,骨关节切除组是假手术组的1.26倍,肌肉切除组是假手术组的0.96倍。三种造模方法中只有骨关节切除法和肌肉+骨关节切除法可以引起黄韧带背侧层厚度及其所占比例的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法。（2）Masson染色与纤维化程度:三种造模方法均可以引起黄韧带的弹性-胶原纤维比值的下降,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的弹性-胶原纤维比是假手术组的0.43倍,骨关节切除组是假手术组的0.66倍,肌肉切除组是假手术组的0.95倍。（3）影像学测量:三种造模方法均可以造成屈曲位椎间隙后方高度和活动范围的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,骨关节切除法次之,最后是肌肉切除法。（4）免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR:①免疫组化结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-smad2/3、Col 1 和 Col 3的蛋白表达量最多,Smad7的表达量最少,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;②免疫印迹结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1和Col 1的蛋白表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;③Real-Time PCR结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col1和Col 3的mRNA表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。（5）造模术后12w时假手术组的弹性-胶原纤维的比值为2.79,将其与实验一中数据比较,其退变程度类似于人未增厚的黄韧带（2.92）;肌肉切除组的弹性-胶原纤维的比值为2.65,退变程度仍接近人未增厚的黄韧带（2.92）;骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.84,退变程度接近人轻度肥厚的黄韧带（1.66-2.23）;肌肉+骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.19,退变程度与人中度肥厚的黄韧带相近（1.08-1.66）。结论:（1）建立了一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,其退变程度可能类似于人类中度肥厚的黄韧带。（2）三种造模方法均能引起黄韧带退变与增厚,其程度依次为肌肉+骨关节切除法>骨关节切除法>肌肉切除法。（3）在大鼠模型中,黄韧带背侧层的增厚占比例最高,这可能是由于背侧层在屈曲位受到更大的应力导致的。说明机械应力可能是诱发或加速黄韧带增厚的重要因素。（4）腰椎屈曲范围的增加所引发的机械应力可导致黄韧带中炎性因子TNF-α、IL-1 β的高表达,并诱导TGF-β 1/Smads通路致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。
崔学磊[2]（2021）在《乳腺癌扩增序列BCAS1调控人左脑认知网络计算》文中提出本文构建了人左脑乳腺癌扩增序列（BCAS1）反馈/上/下游激活和抑制的分子及知识网络,其与认知密切相关。本文通过整合GRNInfer和DAVID,基于BCAS1反馈/上/下游激活和抑制不同分子的共同知识,提出BCAS1调控人左脑认知的新系统机制并完成的多重亚网验证如下:整合BCAS1上游激活、下游激活癌症通路,本文提出并验证BCAS1的癌症通路诱导人左脑认知,通过其上游激活内分泌和中枢神经系统|细胞外空间|鞘脂信号转导通路|细胞运动|粘着斑存在于ZFP36L2,DDIT4,LGALS3BP亚网;或下游激活β连环蛋白结合|成神经细胞增殖的负调节|间隙连接组装|轴突再生|细胞间粘附信号转导|肌动蛋白细胞骨架存在于HSPA2,AF016004亚网。（1）BCAS1正自反馈激活癌症通路通过内分泌和中枢神经系统|细胞外空间|鞘脂信号转导通路|细胞运动|粘着斑| β连环蛋白结合|成神经细胞增殖的负调节|间隙连接组装|轴突再生|细胞间粘附信号转导|肌动蛋白细胞骨架影响认知并正向验证。（2）BCAS1正自反馈抑制蛋白激酶活性;其反馈和下游抑制蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性;其反馈和下游抑制肽基丝氨酸磷酸化;其上游和下游抑制大脑发育;其上游和反馈抑制细胞周期以负向验证。（3）通过BCAS1不同游的负自反馈激活或抑制网络,提出BCAS1限速MAPK、血管内皮生长因子受体、FCε受体、小GTP酶介导的信号转导,凋亡过程的正负调节,血小板活化,DNA模板化转录的调节、蛋白激酶、未折叠的蛋白和ATP结合,结构分子活性,内吞作用,胞液以负向验证。综上,本文提出并验证了 BCAS1影响认知的新系统机制。而这个新系统分析为人左脑认知理论和应用研究增加了新的内容,为人左脑认知机制的研究提供了重要的理论基础并具备应用价值。
吕健[3]（2021）在《芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风病的临床评价与疗效机制研究》文中研究说明芪龙胶囊（国药准字Z20000097,医保乙类）以“益气活血”立法,补气与活血并重,主要用于气虚血瘀证缺血性中风病。但芪龙胶囊在真实世界临床实践中的临床疗效尚未有过评价,且疗效机制尚不清楚。中药复方具有成分复杂、靶点通路多样等特点。为解决芪龙胶囊在真实世界中临床疗效不明确的临床问题,及其疗效机制不清楚的科学问题,本研究通过前瞻性队列研究证明了芪龙胶囊在真实临床实践中的临床疗效,并采用 RNA 测序（RNA-sequencing,RNA-Seq）技术与实时荧光定量 PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）验证技术,筛选出芪龙胶囊发挥疗效所调控的关键基因以及信号通路与生物过程。本研究为芪龙胶囊临床精准定位于气虚血瘀证缺血性中风病提供了真实世界证据,并从转录组学层面揭示了芪龙胶囊“多成分-多靶点-多通路”的疗效机制,为临床精准定位于气虚血瘀证缺血性中风病提供了生物学客观依据。目的通过前瞻性队列研究,评价芪龙胶囊在真实临床实践中治疗气虚血瘀证缺血性中风病的临床疗效,并采用RNA-Seq高通量测序与RT-qPCR验证技术,筛选芪龙胶囊调控的关键基因以及信号通路与生物过程,阐释其疗效机制。方法1.芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风病的前瞻性队列研究:研究对象为气虚血瘀证缺血性中风患者,以服用芪龙胶囊为暴露因素,形成暴露组与非暴露组,所有入组患者均进行基础治疗;总样本量不少于2249例;主要结局指标为Rankin评分量表（mRS评分）、美国国立卫生院神经功能缺损评分（National Institute of Health stroke scale,NIHSS）和Barthel指数量表（BI评分）,次要结局指标包括中医证候（气虚证评分、血瘀证评分）、心理指标（抑郁自评量表SDS评分、焦虑自评量表SAS评分）、血脂指标、凝血指标、同型半胱氨酸;分别于治疗结束后第12周、24周对患者进行现场随访以评估疗效。使用插补法处理缺失数据,使用倾向性评分匹配法（Propensity Score Matching,PSM）处理混杂因素,通过差值检验法、对齐秩转换方差分析（Aligned Ranks Transformation ANOVA,ART ANOVA）、广义线性混合模型（Generalized Linear Mixed Model,GLMM）评价临床疗效。研究结果遵循STROBE-cohort study规范进行报告。2.基于RNA-Seq高通量测序的芪龙胶囊干预后差异表达mRNA研究:（1）血样为临床试验中分别于基线与芪龙胶囊治疗12周后所取患者的全血,采血管为2.5ml Paxgene Blood RNA tube,依据患者12周治疗后NIHSS评分、mRS评分降低数值最大且BI评分提高数值最大筛选原则,选取了 20名患者治疗前后的全血,共计40个血样。（2）治疗前分组为20名患者治疗前血样（20个生物样本重复）,治疗后分组为此20名患者服用芪龙胶囊治疗12周后血样（20个生物样本重复）。除主分析组外,还依据患者临床特征进行了亚组的设置,包括性别（男、女）、年龄（年龄≤60岁、年龄>60岁）、初发与复发。（3）实验方法主要为样本总RNA提取、总RNA质控、文库构建与测序、测序数据的过滤与质控、差异基因检测、差异基因富集分析6个过程。（4）差异基因筛选使用DEGseq方法,为了提高筛选的准确性,我们定义log2 Fold Change≥1并且Q-value≤0.001的基因,筛选为芪龙胶囊干预后显着差异表达基因。（5）对差异基因进行GO功能与KEGG Pathway富集分析,计算得到的P-value分别通过Bonferroni与FDR校正后,以P-value或Q-value（corrected P-value）<0.05为阈值,满足此条件的GO term和Pathway定义为在候选基因中显着富集的GO term与KEGG Pathway,通过GO功能与KEGG Pathway显着性富集分析能确定差异基因行使的主要信号转导途径与生物学功能。3.基于RT-qPCR的芪龙胶囊干预后关键基因与调控机制研究:（1）选取测序结果中差异表达显着性大且基因表达量较高的基因AREG、CAV2、PEDS1-UBE2V1、MYL9、ITGA2B、CXCL8、LY96、GNG10、CXCL10进行验证,以β肌动蛋白（β-actin）为内参基因。（2）选取RNA-Seq高通量测序部分同一批患者血样RNA进行验证实验,共10名患者（女性3例、男性7例;年龄≤60岁5例、年龄>60岁5例;初发6例、复发4例）,20个血样RNA进行验证（治疗前、治疗后）。（3）实验方法包括样本总RNA质检、mRNA逆转录、实时荧光定量PCR扩增（序列与引物设计、PCR反应体系）。（4）使用2⊿⊿Ct法分析实时定量PCR实验中目标基因干预后表达相对变化,将治疗前和治疗后各10个样本的三次重复平均Ct与平均内参Ct统一计算为两组的均值,然后以治疗前为对照（2-⊿⊿Ct=1）,计算每个目标基因在治疗后与治疗前中表达量比值2-⊿⊿Ct,若比值>1,则干预后此基因表达量上调;若比值<1,则表达量下调。以此判断验证的目标基因与转录组测序上下调趋势是否一致。同时结合转录组测序富集结果,阐释关键基因调控的主要信号通路与生物过程。结果1.芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风病的前瞻性队列研究:（1）从2016年11月3日～2019年1月16日,共筛选了 2468例患者,基线入组时因不符合入组标准排除97例,共2371例患者进入研究队列,第12周、24周随访共剔除与失访69例,最终纳入分析合格病例2302例（暴露组1260例、非暴露组1042例）。（2）2302例全数据集治疗前后差值组间比较:①在治疗后第24周,芪龙胶囊联合基础治疗在降低mRS评分、NIHSS评分、气虚证评分、血瘀证评分、SDS评分、SAS评分和提高BI评分方面优于单用基础治疗（P<0.05）;②在治疗后第12周,芪龙胶囊联合基础治疗在降低总胆固醇含量方面优于单用基础治疗（P<0.05）。（3）PSM 600例子数据集治疗前后差值组间比较:①在治疗后第24周,芪龙胶囊联合基础治疗在降低mRS评分、NIHSS评分、气虚证评分、血瘀证评分、SAS评分和提高BI评分方面优于单用基础治疗（P<0.05）;②在治疗后第12周,芪龙胶囊联合基础治疗在降低甘油三酯含量方面优于单用基础治疗（P<0.05）。（4）600例子数据集对齐秩转换方差分析模型:三次测量的主要结局指标分析结果显示,mRS评分和BI评分在分组的P值小于0.05,说明mRS评分和BI评分各组的数据的差异有统计学意义,而分组和测量次数交互作用的P值大于0.05,说明测量次数和分组无交互作用;NIHSS评分在测量次数的P值小于0.05,则说明NIHSS评分在各个测量时间的数据的差异有统计学意义,而分组和测量交互作用的P值大于0.05,说明测量次数和分组无交互作用。（5）广义线性混合模型分析:分别在2302例全数据与600例子数据集进行mRS评分、NIHSS评分、BI评分建模,结果显示:①在mRS评分方面,600例子数据集中暴露组受试者mRS评分的odds ratio的估计随时间每次下降99.83%,非暴露组的受试者mRS评分的odds ratio的估计随时间每次下降95.8%,暴露组患者的mRS评分下降速度快于非暴露组,且差异显着（P<0.05）;2302例全数据集结果显示,暴露组受试者mRS评分的odds ratio的估计随时间每次下降99.82%,非暴露组受试者mRS评分的odds ratio的估计随时间每次下降97%,暴露组患者的mRS评分下降速度快于非暴露组,且差异有统计学意义（P<0.05）。②在NIHSS评分方面,600例子数据集结果显示,暴露组受试者NIHSS评分的odds ratio的估计随时间每次下降99.98%,非暴露组受试者NIHSS评分的odds ratio的估计随时间每次下降99.77%,暴露组受试者的NIHSS评分下降速度快于非暴露组,且差异有统计学意义（P<0.05）;2302例全数据集结果显示,暴露组受试者NIHSS评分的odds ratio的估计随时间每次下降99.99%,非暴露组受试者NIHSS评分的odds ratio的估计随时间每次下降99.97%,暴露组患者的NIHSS评分下降速度快于非暴露组,且差异有统计学意义（P<0.05）。③在BI评分方面,600例子数据集结果显示,暴露组患者的BI评分上升速度快于非暴露组,且差异有统计学意义（P<0.05）。2.基于RNA-Seq高通量测序的芪龙胶囊干预后差异表达mRNA研究:（1）40个样本总RNA平均浓度为282.08 ng/μL,平均总量为5.61μg;RIN值除了两个样本为6.6和5.1,其余均高于7,28S/18S在1.3～2.9之间,表明40个总RNA纯度和完整度较高,符合后续建库与测序的要求。（2）使用DNBSEQ平台进行测序,40个样品共产出1869.27Mb原始数据,原始数据经过过滤后,共有1619.21Mb（86.62%）的原始数据作为高质量读段（Cleanreads）被保留下来,说明测序数据结果较好,大部分读段被保留下来,且样本间Clean reads差异较小,可用于后续分析。（3）显着差异基因检测结果显示,主分析组干预后检测到的差异基因有39个;男性亚组检测到的差异基因有40个;女性亚组检测到的差异基因有151个;年龄≤60岁亚组检测到的差异基因有61个;年龄>60岁亚组检测到的差异基因有84个;初发亚组检测到的差异基因有52个;复发亚组检测到的差异基因有102个。（4）富集分析显示,芪龙胶囊主要通过调控以下5个方面信号通路与生物功能改善患者炎症与动脉粥样硬化情况,修复神经功能缺损。分别为:①免疫反应（LY96、CXCL8、CXCL10等参与免疫反应调节,LY96、HP、HLA-DRB5等参与免疫系统过程）;②炎症反应相关信号通路（LY96、CXCL8、CXCL10等参与炎症反应调控,AREG、ITGA2B、FN1等参与PI3K-AKT信号通路调控,ITGA2B、FN1、GP1BB等参与ECM-受体相互作用调控,AREG、CAV2参与MAPK级联反应的正调控,GNG10、CXCL10、CXCL8等参与趋化因子信号通路调控,PEDS1-UBE2V1、CXCL8、CXCL1等参与IL-17信号通路调控,LY96、CXCL8、CCL4L1等参与NF-κB信号通路调控,LY96、CXCL8、CAV1等参与Toll样受体信号通路调控,CXCL8、CXCL1、CCL4L1等参与到细胞因子受体的相互作用,FN1、ARG1、CAV1等参与到TGF-β信号通路,DAAM2、CAV1、BAMBI等参与Wnt信号通路调控）;③动脉粥样硬化调控（CAV2、ITGA2B、GSTT1等参与流体剪切应力与动脉粥样硬化调控）;④细胞相关功能调控（AREG、CAV2、IGFBP2等参与到细胞增殖与分化调控,CXCL8、E2F1、KIR2DL1等参与到细胞衰老,HBA1、HBB、HP等参与到细胞凋亡及清除,CAV2、ITGA2B、CAV1等参与细胞粘附调控,ITGA2B、MYL9、FN1等参与白细胞迁移调控）;⑤血压调节（AREG、KLK1、HBB等参与到血压调节）。3.基于RT-qPCR的芪龙胶囊干预后关键基因与调控机制研究:（1）20个样本浓度在200-700 ng/μl之间,纯度在2.0-2.3之间,浓度与纯度符合下一步反转录和扩增实验要求,且电泳检测所有样本RNA质量显示良好。（2）PCR扩增后,扩增曲线图显示目的基因和内参的扩增效率基本一致;熔解曲线是单峰,说明产物只有一条,特异性较好,PCR扩增结果较好。（3）RT-qPCR结果显示,基因AREG、CAV2、ITGA2B、PEDS1-UBE2V1、MYL9在治疗后的表达量比值2-⊿⊿Ct均大于1,即相对于治疗前在干预后的表达量上调;基因LY96、GNG10在治疗后的表达量比值2-⊿⊿Ct均小于1,即相对于治疗前在干预后的表达量下调。（4）基因AREG、CAV2、PEDS1-UBE2V1、MYL9、ITGA2B、LY96、GNG10的表达水平与RNA-Seq高通量测序相应基因的上下调趋势一致,一方面说明 AREG、CAV2、PEDS1-UBE2V1、MYL9、ITGA2B、LY96、GNG10可能是芪龙胶囊调控的关键基因;另一方面说明RT-qPCR验证结果与RNA-Seq高通量测序结果整体一致性较高,测序结果比较可靠。依据转录组测序富集分析结果发现,芪龙胶囊通过以上关键基因参与到免疫反应、炎症反应相关信号通路、动脉粥样硬化、细胞相关功能、血压调节等关键信号通路与生物过程调控。结论1.在常规治疗基础上,使用芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风患者可显着降低mRS评分、NIHSS评分、气虚证评分、血瘀证评分、SDS评分、SAS评分、总胆固醇含量、甘油三酯含量并提高BI评分,改善神经功能缺损、气虚血瘀与抑郁焦虑情况,降低患者血脂,提高患者日常生活能力,且安全性较好。真实世界临床实践中,芪龙胶囊临床精准定位于气虚血瘀证缺血性中风病疗效显着。2.芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风患者主要通过调控AREG、CAV2、PEDS1-UBE2V1、MYL9、ITGA2B、LY96、GNG10等关键基因的表达,参与免疫反应、炎症反应相关信号通路（炎症反应调控、PI3K-AKT信号通路、ECM-受体相互作用、MAPK级联反应的正调控、趋化因子信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路）、动脉粥样硬化调控、细胞相关功能（细胞增殖与分化、细胞粘附、白细胞迁移）、血压调节等关键信号通路与生物过程,改善患者的炎症与动脉粥样硬化情况,促进神经细胞与组织再生,恢复神经功能,提高日常生活能力。其中君药黄芪与免疫反应、炎症反应相关信号通路与动脉粥样硬化调控相关,君药地龙与动脉粥样硬化调控、细胞相关功能、血压调节相关,臣药丹参、当归、赤芍、川芎、红花、桃仁与炎症反应相关信号通路、动脉粥样硬化调控、细胞相关功能、血压调节相关。芪龙胶囊在以上药物配伍作用下,以益气活血、化瘀通络立法,共同参与到以上5个关键信号通路与生物过程。本研究从转录组水平阐释了芪龙胶囊临床精准定位于气虚血瘀证缺血性中风病的疗效机制。创新点1.将倾向性评分匹配法与对齐秩变换方差分析、广义线性混合模型相结合,通过前瞻性队列研究证实了真实临床实践中芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风病的临床疗效,为临床精准定位于气虚血瘀证提供了真实世界证据;2.采用RNA-Seq高通量测序技术与RT-qPCR验证技术,发现芪龙胶囊主要通过调控 AREG、CAV2、PEDS1-UBE2V1、MYL9、ITGA2B、LY96、GNG10 等关键基因的表达,参与免疫反应、炎症反应相关信号通路、动脉粥样硬化、细胞相关功能、血压调节等关键通路与生物过程,初步阐释了芪龙胶囊的“多成分-多靶点-多通路”的疗效机制,为临床精准定位提供了生物学客观依据。
张亮[4]（2021）在《基于中医象思维探讨肾衰饮干预慢性肾功能衰竭大鼠的机制研究》文中指出目的:基于中医象思维研究肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路、Fas/Fas L介导的凋亡途径、PI3K/Akt信号通路的影响,探讨该方防治慢性肾功能衰竭的作用机制。材料与方法:选取6周龄SPF级健康雄性SD大鼠84只,随机抽取12只大鼠为正常组,其余72只为造模组。造模组大鼠应用腺嘌呤（200mg/（kg·d））灌胃3周建立慢性肾功能衰竭大鼠模型,将造模成功大鼠再随机分为模型组、肾衰饮组、尿毒清组、P13K抑制剂组（LY组）及肾衰饮+LY组。正常组和模型组予0.9%Nacl溶液8ml/（kg·d）灌胃。肾衰饮组给予中药复方汤剂肾衰饮煎剂按生药量33.3g/（kg·d）灌胃。尿毒清组给予尿毒清颗粒以2.25g/（kg·d）浓度灌胃。LY组给予腹腔注射P13K抑制剂（LY294002）稀释液50mg/kg,周一次。肾衰饮+LY组在给予肾衰饮煎剂按生药量33.3g/（kg·d）灌胃基础上腹腔注射LY294002稀释液50mg/kg,周一次。以上各组大鼠均连续用药4周。各组分别留取大鼠血清及肾组织,检测各项指标。实验一:观察大鼠一般状态,肉眼观察肾脏外观形态,光镜下观察大鼠肾组织病理改变及TUNEL染色法检测凋亡细胞情况。全自动生化分析仪检验大鼠血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平。酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平。实验二:免疫印迹法（Western Blot法）和免疫组织化学法检测大鼠肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达情况。实验三:Western Blot法检测肾脏组织Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达情况。实验四:Western Blot法检测肾脏组织Akt、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达情况。结果:1肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏形态学及肾功能的影响1.1肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠一般状态的影响正常组:精神状态良好,毛色光泽,较少有脱毛现象,活动正常,反应灵活,每日进食量及饮水量均正常,垫料气味较淡,大鼠便质如常排便未见异常。模型组:体重明显下降,精神状态萎靡,毛色干枯晦暗,并出现脱毛现象,反应迟钝,活动减少,进食量减少,饮水量增加,垫料气味臭秽,稀便。尿毒清组:体重不同程度下降,精神状态萎靡,毛色干枯、脱落,精神中度萎靡,反应略有迟钝,活动减少,进食量减少,饮水量增多,垫料气味臭秽,稀便。肾衰饮组:体重不同程度下降,精神轻度萎靡,毛色干枯脱毛现象较轻,反应尚可,活动度尚可,进食量尚可,饮水量略增加,垫料气味臭秽,可见便质如常排便未见异常。1.2肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏形态学的影响1.2.1肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏组织外观形态的影响与正常组比较,其余各组大鼠肾脏体积均不同程度的增大,其中模型组改变最为明显,尿毒清组其次,最后为肾衰饮组。与正常组比较,模型组大鼠肾脏组织表面均呈弥漫性细颗粒状改变,凹凸不平,被膜粘连,不易剥离,且外观颜色均明显发白,肉眼观察外观颜色发白程度:模型组>尿毒清组>肾衰饮组>正常组。沿肾门纵行剖开,除空白组外各组肾组织切面处均可见肾皮质不同程度变薄,且皮髓质界限欠清晰,其中模型组最明显,其他各组肉眼观察无明显区别。1.2.2肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠体质量及肾指数的影响各组大鼠实验前及造模第1周体质量比较无明显差异;与正常组比较,第2周、第3周造模组大鼠体质量明显降低（P<0.05）;治疗期间:第1周:与正常组比较,模型组、尿毒清组和肾衰饮组大鼠体质量明显降低（P<0.01）;第2周和第3周:与正常组比较,模型组与尿毒清组大鼠体质量明显降低（P<0.05）,肾衰饮组无明显差异;与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组大鼠体质量无明显差异;第4周:与正常组比较,模型组、尿毒清组和肾衰饮组大鼠体质量明显降低（P<0.01）,肾指数明显升高（P<0.01）,与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组大鼠体质量明显升高（P<0.05）,肾指数降低（尿毒清组P<0.01,肾衰饮组P<0.05）,尿毒清组与肾衰饮组大鼠体质量、肾指数比较无明显差异。1.2.3肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏病理学的影响苏木精-伊红（HE）染色结果:正常组可见肾小球、肾小管、系膜结构正常,间质未见增宽,无炎性细胞浸润。模型组可见肾小球囊腔变大,部分肾小管萎缩,小管的管壁薄厚不匀,肾小管上皮细胞弥漫空泡变性,成纤维细胞增多,系膜细胞增生明显,肾小球周围可见大量炎性细胞浸润。尿毒清组可见肾小管上皮细胞空泡变性减轻,系膜细胞轻度增生,部分区域伴有炎性细胞浸润。肾衰饮组可见成纤维细胞减少,系膜细胞轻度增生,部分区域伴有炎性细胞浸润。肾衰饮组在肾小管上皮细胞空泡变性及系膜细胞增生程度均低于尿毒清组。1.3肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠血清Scr、BUN水平的影响与正常组比较,模型组血清Scr、BUN水平明显升高（P<0.01）;与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组血清Scr、BUN水平均明显降低（P<0.01）,尿毒清组和肾衰饮组比较无统计学差异。2肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡情况的影响TUNEL染色后显微镜下观察:正常组大鼠肾脏组织中细胞正常,未见阳性细胞;模型组大鼠肾脏细胞凋亡数量明显增多,且主要分布在髓质区;尿毒清组和肾衰饮组大鼠肾脏细胞凋亡指数较模型组降低（P<0.01）;尿毒清组和肾衰饮组相比差异无统计学意义。3肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影响ELISA法检测大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平:与正常组比较,模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平明显升高（P<0.01）;与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平均明显降低（P<0.01）;与尿毒清组比较,肾衰饮组大鼠血清IL-6、TNF-α表达水平降低（P<0.05）。4肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平的影响Western blot法检测肾脏组织内TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平:与正常组相比,模型组大鼠肾脏组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）;与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组大鼠肾脏组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）,尿毒清组和肾衰饮组比较无统计学差异。免疫组织化学法检测各组大鼠肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达情况:光镜下观察,正常组肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达为阴性,模型组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白呈强阳性表达,尿毒清颗粒和肾衰饮干预后均能不同程度的减少TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表达（P<0.01）,且两组之间无明显差异。5肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏组织Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达的影响Western blot法检测肾脏组织Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达:与正常组比较,模型组大鼠肾脏组织Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达水平显着增高（P<0.01）;与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组大鼠肾脏组织Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）;尿毒清组和肾衰饮组相比差异均无显着性意义。6肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏组织PI3K/Akt信号通路蛋白表达的影响各组大鼠肾脏组织Akt蛋白表达无明显差异。与正常组比较,模型组大鼠肾脏组织p-Akt蛋白表达水平降低（P<0.01）,p-Akt/Akt比值降低（P<0.01）;与模型组比较,P13K抑制剂组（LY组）大鼠肾脏组织p-Akt蛋白表达水平显着降低（P<0.01）,p-Akt/Akt比值显着降低（P<0.01）;与LY组比较,肾衰饮+LY组大鼠肾脏组织p-Akt蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,p-Akt/Akt比值显着升高（P<0.01）。结论:1基于中医象思维,根据肾藏象的病理之象,提出脾肾虚损是慢性肾功能衰竭发生和发展的病理基础,是产生毒邪的根源;毒邪（湿毒、痰毒、瘀毒）是加重病情进展恶化及迁延不愈的重要外因,证属本虚标实。2拟“抗毒、解毒、排毒”三法于一方,肾衰饮健脾益肾扶正以抗毒;祛湿涤痰化瘀以解毒;通腑泄浊以排毒,攻补兼施。3根据以上病因病机、治则治法,实验研究表明:（1）肾衰饮能够明显改善腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭模型大鼠的一般状态及肾功能,减轻肾脏组织病理损伤,抑制肾脏炎症反应和细胞凋亡,进一步抑制肾脏纤维化,达到治疗慢性肾功能衰竭的目的;（2）肾衰饮能够降低腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭模型大鼠肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达,从而抑制炎症反应,减轻肾脏炎性损伤;（3）肾衰饮能够降低腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭模型大鼠Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达水平,对肾脏细胞凋亡起到抑制作用;（4）肾衰饮可能通过激活PI3K/Akt信号通路,进一步抑制其下游的效应靶点Fas L来抑制慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡。
王生淋[5]（2021）在《Stattic对表皮生长因子受体抑制介导的骨肉瘤生物学活性的影响》文中研究说明第一部分EGFR酪氨酸激酶抑制剂对骨肉瘤生物学活性的影响目的:骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是最常见的来源于骨组织的恶性肿瘤,常发生于儿童和青少年,具有很高的转移潜能。表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）是多种肿瘤发生的驱动因素,针对EGFR的酪氨酸激酶抑制剂对多种类型的实体肿瘤患者表现出令人鼓舞的抗肿瘤活性,然而其对OS作用的研究仍存在较大争议。本部分研究旨在明确EGFR的酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼（Gefitinib）对OS的抗肿瘤活性,并探讨其作用机制。方法:首先使用免疫印迹实验（Western blot）和实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-q PCR）检测人OS细胞与正常成骨细胞EGFR表达。通过CCK-8法、克隆形成实验、裸鼠皮下移植瘤模型检测吉非替尼对OS细胞增殖和肿瘤生长的影响。使用Transwell法和Western blot检测吉非替尼对OS细胞的迁移、侵袭的影响及其机制。使用流式细胞计数法和Western blot探讨吉非替尼对OS细胞凋亡和周期的影响及相关机制。为了研究吉非替尼影响OS细胞的机制,我们使用Western blot检测EGFR、蛋白激酶B（Akt）,细胞外信号调节激酶（ERK）和信号转导和转录激活因子3（STAT3）蛋白的表达。结果:Western blot和RT-q PCR结果表明,具有成纤维细胞或混合特性的MG63、143B和MNNG-HOS细胞中EGFR蛋白和基因表达升高,与成骨细胞比,基因表达差异具有统计学意义（P<0.01）;而具有上皮特征的U2OS和Saos-2细胞EGFR蛋白和基因呈现为低表达状态。吉非替尼以剂量依赖的方式抑制了OS细胞增殖和移植瘤生长。Transwell实验结果表明吉非替尼通过升高E-cad和降低N-cad表达抑制了OS细胞的迁移和侵袭。此外,吉非替尼处理后,OS细胞凋亡增加,G1期细胞比例增多,与对照组相比差异均具有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果表现为Bax/Bcl-2比值和P27的增加,以及细胞周期蛋白D1（cyclin D1）和细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）的减少。进一步的机制研究表明,吉非替尼抑制EGFR、Akt和ERK的磷酸化,然而提高了STAT3的磷酸化水平。吉非替尼对EGFR、Akt、ERK和STAT3总蛋白的水平无显着影响。结论:吉非替尼通过阻断EGFR及Akt、ERK信号通路激活从而抑制OS的发生和转移,并促进OS细胞G1期阻滞和细胞凋亡。吉非替尼介导的STAT3蛋白负反馈激活可能参与了OS细胞对EGFR抑制剂的抵抗机制。第二部分EGFR沉默表达对骨肉瘤生物学活性的影响目的:第一部分的研究结果表明,EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼能够抑制OS细胞的生物学活性。然而,EGFR活性抑制对OS发生和进展的影响还需要进一步探究。本部分研究旨在明确OS中EGFR蛋白表达抑制的抗肿瘤活性。方法:使用EGFR沉默（sh-EGFR）和对照（sh-NC）慢病毒转染OS细胞,并通过RT-q PCR和Western blot检测慢病毒转染后EGFR的m RNA和蛋白表达变化。通过CCK-8法、克隆形成实验和构建裸鼠皮下移植瘤模型观察EGFR沉默对OS细胞增殖和肿瘤生长的影响。通过Transwell法观察EGFR沉默对OS细胞迁移和侵袭能力的影响。通过流式细胞计数法观察EGFR沉默对OS细胞凋亡和周期分布的影响。结果:RT-q PCR和Western blot结果显示sh-EGFR组143B和U2OS细胞EGFR的m RNA和蛋白表达均明显低于各自的sh-NC组,差异具有统计学意义（P<0.01）。sh-EGFR组143B和U2OS细胞的增殖、集落形成数量和裸鼠移植瘤生长明显低于各自的sh-NC组,差异具有统计学意义（P<0.01）。Transwell实验结果表明sh-EGFR组143B和U2OS细胞发生迁移和侵袭的数量显着少于各自的sh-NC组（P<0.01）。流式细胞计数结果表明,EGFR沉默后,143B和U2OS细胞凋亡比例增加,并且G1期细胞增多,S期期细胞减少,与对照组相比差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:慢病毒沉默EGFR表达能够抑制OS细胞的增殖、肿瘤生长、细胞迁移和侵袭,并促进OS细胞G1期阻滞和细胞凋亡。第三部分Stattic对吉非替尼介导的骨肉瘤生物学活性的影响目的:第一部分的研究中观察到,吉非替尼介导的EGFR磷酸化抑制能负反馈激活STAT3蛋白发生磷酸化。有研究表明,软组织肉瘤中STAT3磷酸化与肿瘤对吉非替尼的耐药性相关。然而,OS中EGFR与STAT3的相互作用尚未见相关报道。本部分研究旨在探讨OS中STAT3在吉非替尼介导的抗肿瘤活性中的作用及其相关机制。方法:首先使用Western blot检测STAT3酪氨酸激酶抑制剂Stattic处理OS细胞后EGFR蛋白的变化。通过CCK-8实验、克隆形成实验和构建裸鼠皮下移植瘤模型比较吉非替尼（G）、Stattic（S）及两者联用（G+S）对OS细胞增殖和肿瘤生长的影响。使用Transwell法和Western blot比较G、S及G+S处理对OS细胞迁移和侵袭的影响及E-cad和N-cad的变化。使用流式细胞计数法比较G、S及G+S处理对OS细胞凋亡和细胞周期分布的影响,并使用Western blot检测周期和凋亡相关蛋白表达的变化。最后,通过Western blot检测G、S及G+S处理后OS细胞EGFR、Akt,ERK和STAT3蛋白的表达变化。结果:Western blot结果表明,S使p-STAT3表达水平降低,然而却升高了p-EGFR水平。CCK-8实验结果表明,G+S组对143B和U2OS细胞的半抑制浓度低于G组或者S组。并且,G+S组143B和U2OS细胞的集落形成数量、裸鼠移植瘤体积和重量均显着小于各自的G组和S组,差异具有统计学意义（P<0.05）。G+S组143B和U2OS细胞发生迁移和穿过基质胶的细胞数量显着少于各自的G组和S组,差异具有统计学意义（P<0.001）。Western blot结果表明,与G组和S组相比,G+S组OS细胞E-cad表达最高,而N-cad表达最低。此外,G+S组OS细胞发生凋亡的比例和G1期细胞比例显着多于各自的G组和S组OS细胞,差异均具有统计学意义（P<0.01）。Western blot结果表现为G+S组OS细胞Bax/Bcl-2比值和P27增加最明显,而cyclin D1和CDK4减少最明显。进一步的机制研究表明,G+S组同时抑制了EGFR和STAT3的磷酸化水平,并且p-Akt和p-ERK水平也低于G组和S组。G、S及G+S对EGFR、Akt、ERK和STAT3总蛋白的水平均无显着影响。结论:Stattic通过抑制STAT3磷酸化阻断STAT3与EGFR之间的负反馈激活通路,从而增加吉非替尼对OS细胞增殖和转移的抑制,以及对肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞的促进。EGFR和STAT3的联合靶向治疗有望成为OS治疗的潜在方案。第四部分Stattic对EGFR沉默表达介导的骨肉瘤生物学活性的影响目的:第三部分的研究中观察到,Stattic能够增加吉非替尼介导的抗OS细胞增殖、肿瘤生长、细胞迁移和侵袭,以及增加吉非替尼对细胞周期进展阻断和细胞凋亡的促进。然而,Stattic对OS细胞中EGFR沉默产生的生物学活性影响的协同作用还需要进一步验证。本部分研究旨在探究Stattic在EGFR沉默介导的抗OS活性中的协同作用。方法:通过CCK-8实验和克隆形成实验分别比较Stattic（S）处理的EGFR沉默（sh-EGFR）和对照（sh-NC）组143B和U2OS细胞的增殖和集落形成数量差异。通过Transwell法比较S处理的sh-EGFR和sh-NC组OS细胞的迁移和侵袭数量差异。使用流式细胞计数法比较S处理的sh-EGFR和sh-NC组OS细胞凋亡比例和细胞周期分布变化。结果:在相同S浓度作用下,sh-EGFR组143B和U2OS细胞的半抑制浓度均低于各自的sh-NC组细胞。sh-EGFR+S组143B和U2OS细胞的集落形成数量显着少于各自的sh-EGFR组和S组,差异具有统计学意义（P<0.001）。sh-EGFR+S组143B和U2OS细胞发生迁移和穿过基质胶的数量显着少于各自的sh-EGFR组和S组,差异具有统计学意义（P<0.01）。此外,sh-EGFR+S组OS细胞发生凋亡的比例和G1期比例显着多于sh-EGFR组和S组OS细胞,差异具有统计学意义（P<0.001）。结论:Stattic增加EGFR沉默对OS细胞增殖、迁移和侵袭的抑制,以及对OS细胞凋亡和细胞G1期阻滞的促进。未来的OS治疗中应考虑EGFR和STAT3的联合靶向治疗方案。
田园硕[6]（2021）在《活血软坚扶正方干预乙肝后肝纤维化的临床疗效研究及机制探索》文中研究表明研究目的:本研究通过网络药理学方法筛选活血软坚扶正方治疗乙肝后肝纤维化的作用靶点、信号通路;通过临床研究观察活血软坚扶正方对气虚血瘀型乙肝后肝纤维化患者的有效性和安全性,并通过对人转化生长因子β 1、金属蛋白酶抑制因子1浓度的测定,探讨活血软坚扶正方干预本病的可能疗效机制,为临床应用提供科学依据。研究方法:1.网络药理学研究:采用 TCMSP、TCMID、SwissTargetPrediction、PubChem、DisGeNET、OMIM、GeneCards等数据库筛选活血软坚扶正方活性成分及与乙肝后肝纤维化相关靶基因,采用Cytoscape软件构建“方药-成分-靶点-疾病”网络图,采用String数据库构建蛋白质相互作用网络,采用Metascape对活血软坚扶正方治疗乙肝后肝纤维化关键作用靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析,获取活血软坚扶正方治疗乙肝后肝纤维化的主要生物过程和信号通路。2.临床试验研究:采用随机数分组方法,将符合纳入标准、不符合排除标准的63例气虚血瘀型乙肝后肝纤维化患者随机分为中药组和对照组,中药组33例（后脱落3例）,对照组30例。在抗病毒治疗的基础上,中药组予活血软坚扶正方,对照组予复方鳖甲软肝片,连续干预6个月。两组均于治疗前后记录中医证候评分、检测肝弹性值,检查肝功能、血清蛋白、凝血功能、肝纤四项、人转化生长因子β1、血清金属蛋白酶抑制因子1,计算无创肝纤维化指标（APRI、FIB-4）,并在治疗前、治疗3个月、治疗6个月时检测血、尿、便常规等安全性指标。观察比较两组患者治疗前后的肝弹性值、肝纤四项、APRI、FIB-4、肝功能、血清蛋白、凝血功能、人转化生长因子β1、血清金属蛋白酶抑制因子1、中医证候评分以及相关安全性指标的变化,并统计分析。研究结果:1.网络药理学研究结果研究最终共筛选获取33个活性成分,129个作用靶点与活血软坚扶正方治疗乙肝后肝纤维化密切相关。活血软坚扶正治疗乙肝后肝纤维化主要涉及生物过程、细胞组成、分子功能等多层次功能,通过调节PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路、phospholipase D信号通路、HIF-1α信号通路、FoxO信号通路、JAK-STAT信号通路、IL-17信号通路、MAPK信号通路、AMPK信号通路、TNF信号通路、PPARγ信号通路等多个通路等来发挥治疗作用。2.临床试验研究结果（1）影像学肝纤维化指标:中药组和对照组组内对比均能够显着降低患者的肝弹性值（P<0.01）,且中药组疗效优于对照组（P<0.05）。（2）血清学肝纤维化指标:中药组能显着降低血清中CIV的水平（P<0.01）,对照组治疗前后CIV无明显差异（3）无创肝纤维化指标:中药组和对照组组内对比均能降低FIB-4的水平（P<0.05）,且中药组疗效优于对照组（P<0.05）;中药组可显着降低APRI的水平（P<0.01）,对照组治疗前后APRI无显着差异。（4）肝功能相关指标:中药组和对照组组内对比均能显着降低血清中TBIL的水平（P<0.05）,且两组组间无明显差异;中药组可显着降低AST的水平（P<0.01）,对照组治疗前后AST无显着差异。（5）血清蛋白相关指标:两组治疗前后组内对比ALB和GLO水平无显着差异。（6）凝血功能相关指标:中药组可显着升高的PTA和PLT的水平（P<0.01）,对照组无明显PTA和PLT升高。（7）TIMP-1和TGF-β1:中药组可降低血清中TIMP-1的浓度（P>0.05）,对照组能够降低血清中TGF-β1的浓度（P>0.05）,但TIMP-1和TGF-β1组内、组间差异均无统计学意义。（8）中医证候指标:中药组和对照组均能明显降低患者的中医证候评分（P<0.01）,且中药组疗效优于对照组（P<0.01）。结论:1.网络药理学研究提示:活血软坚扶正方改善乙肝后肝纤维化具有多层次、多系统和整体干预的特点。2.通过影像学、血清学、无创肝纤维化指标三种方式的比较,发现:活血软坚扶正方可有效抑制乙肝后肝纤维化的形成。3.活血软坚扶正方能够显着改善气虚血瘀型乙肝后肝纤维化患者的症状、减轻肝脏炎症,调节凝血功能。4.活血软坚扶正方干预血清中金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）和人转化生长因子β1（TGF-β1）的作用不显着,药物对其可能存在一定抑制作用,但是否是主要干预因子尚存疑,需进一步的研究进行验证。
朱安娜[7]（2021）在《基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制》文中进行了进一步梳理目的:基于网络药理学研究方法,探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制。方法:（1）通过TCMSP数据库及查阅文献搜集整理麻黄附子细辛汤化学成分及相关潜在靶点信息,对未搜集到靶点的成分应用Swiss Target Prediction数据库预测补充,综合得到麻黄附子细辛汤化学成分及潜在靶点数据集;（2）于Gene Cards数据库筛选得到病态窦房结综合征相关靶点,整理得到病态窦房结综合征相关的疾病靶点数据集;（3）利用Cytoscape软件展示中药、化学成分和疾病靶点间的关系,构建“麻黄附子细辛汤药物-化学成分-靶点-病态窦房结综合征”生物网络,通过Cyto NCA拓扑分析,得到麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分及相关靶点;（4）应用Ledock软件进行分子对接验证关键化学成分与核心靶点结合的可靠性;（5）利用DAVID、Metascape数据库,分别对作用靶点进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,预测麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的作用机制。结果:（1）通过对麻黄附子细辛汤作用于病态窦房结综合征相关靶点的生物网络进行分析,预测得到麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的199个显效成分,包括芦丁、去甲乌药碱、β-细辛醚等;（2）由拓扑分析得到网络中木犀草素、准葛尔乌头碱、山奈酚等10个关键化学成分及ADRB2、SCN5A、AR等10个核心靶点;（3）经分子对接证实了除外KCNH2的9个核心靶点与关键化学成分都具有较强结合活性,佐证了关键化学成分与核心靶点的可靠性;（4）通过GO功能注释和KEGG通路富集分析,推测麻黄附子细辛汤治疗SSS的作用机制可能为:（1）调节细胞因子活性,抑制甚逆转心肌纤维化,改善SSS发生的病理基础;（2）调节细胞对炎性刺激、缺氧、老化的反应,保护心肌细胞,减轻窦房结及其周围组织的功能单位损伤;（3）调控蛋白质活力和细胞对机械刺激的反应,诱导质膜受体表达,增强窦房结细胞“钙钟”“膜钟”活性,扩张血管,促进窦房结细胞电生理活动正常,改善心律失常和组织器官血流灌注不足症状;（4）影响可能导致SSS发生的相关疾病,限制多疾病对SSS发生的诱导、加重。结论:本研究通过对麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的网络药理学分析及分子对接验证,初步预测了麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制,为麻黄附子细辛汤的临床应用提供了分子生物学层面的理论支持,为其治疗SSS作用机制的深入研究和复方的二次开发提供了一定量的参考信息。
柳颖[8]（2020）在《杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制》文中研究指明目前,农药残留问题仍然是食品安全领域的焦点问题,迫切需要建立快速、可靠的残留分析方法。免疫分析方法以其灵敏度高、检测迅速、易操作等特点,在快速诊断领域占有巨大市场。杂交瘤细胞作为制备免疫分析法的核心元件单抗的主要工程细胞,具有制备技术成熟、抗体表达量多、抗体特异性高等优势。本研究对体外培养条件下,杂交瘤细胞表达农药特异性抗体及其调控机制进行探究,为提高杂交瘤细胞的稳定性以及抗体表达量提供理论基础。研究内容与结果:（1）以百菌清（BJQ）特异性杂交瘤细胞为研究对象,表征了培养过程中出现不分泌特异性抗体的转阴现象,表现为增殖加快、不表达抗体轻链和/或重链蛋白,并对抗体基因及其转录表达进行比对分析,发现阴性细胞特异性抗体基因序列丢失或未丢失但表达量显着下调。（2）选择BJQ抗体基因表达量显着下调的对数生长期的D4细胞株与阳性细胞株E2进行转录组比较分析,发现D4癌基因Pet2上调,抑癌基因Lrig1下调;RNAi验证发现与囊泡转运相关基因Vapa、浆细胞分化关键因子Prdm1以及转录因子Foxb1与抗体表达显着相关。（3）利用CRISPR library对百菌清杂交瘤细胞进行全基因组基因编辑,利用农药压力筛选和流式分选方式对CRISPR敲除细胞文库进行抗体表达升高和降低的全生长周期细胞筛选,对富集的功能基因进行分析和归纳:调控杂交瘤细胞抗体表达的主要“油门”基因为抑癌基因Hivep3、Lrig1,MAPK通路基因Grap、Kras,转录调控因子Cebpb、Foxb1、Prdm1、Prdm2、Pax5,囊泡转运相关蛋白Rab12、Vapa、Vapb;主要“刹车”基因为促癌基因Pet2、Rad51、Rad50、Wnt2、Relb,抑制凋亡的基因Ucp2、Perp,促进周期进程的基因cdc25b、Id1、Plk2、Cdkl2,细胞周期进程中的周期蛋白和激酶,胞间信号传导相关的基因Rabgef1,MAPK及上游受体通路基因Rgs4、Gapt、Ralb、Rasef,PI3k/Akt通路中的基因Akt3。其中Foxb1、Prdm1、Vapa为si RNA干扰验证基因,与抗体表达成显着正向关,Pet2、Ccnd2为sh RNA干扰验证基因,与抗体表达呈显着负相关;并通过Erk/MAPK信号通路调控细胞周期和抗体基因表达。（4）对百菌清免疫各阶段的小鼠脾脏细胞进行转录组分析,发现百菌清刺激后,B细胞激活、增殖和分化为浆细胞的过程主要通过BCR级联的Ras-Erk/MAPK信号通路,启动细胞生长及抗体基因表达,与杂交瘤细胞主要通路一致。（5）对杂交瘤细胞抗体表达及调控机制进行归纳:杂交瘤细胞融合了B细胞表达特异性抗体的基因功能及SP2/0细胞不断增殖分裂的功能,在体外培养阶段两者同步进行并互相制约,通过Erk/MAPK通路及上下游相关调控因子进行细胞生长及抗体表达的调控;平台生长期细胞增殖的抑制可以促进抗体的表达,而因基因突变导致的细胞增殖异常加快会抑制抗体的表达。本研究表征了杂交瘤细胞抗体基因及其表达的多样性,探讨了百菌清特异性杂交瘤细胞抗体的表达及调控机制,明确了主要关键调控因子和信号通路,该研究为进一步提高杂交瘤细胞特异性抗体表达的稳定性及产量提供一定的理论基础。
刘中兵[9]（2020）在《川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究》文中研究指明第一部分:川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应体外研究目的:充分探讨川陈皮素靶向IL-21调控类风湿关节炎免疫应答过程,确定其与IL-21/IL-21R及JAK1/STAT3信号通路在调控过程中的介导关系,确定川陈皮素在类风湿关节炎发生、发展过程中的价值性,为后期临床治疗类风湿关节炎提供研究方向。材料与方法:我们使用的是RASFs细胞系,即MH7A细胞,它来自RA患者,被认为是RA的主要效应细胞。MH7A细胞系使用含10%胎牛血清的1640完全培养基于37℃、5%CO2、100%的恒温培养箱中培养,具体分组如下:Control组（不做处理）;IL-21组（50 ng/ml IL-21处理MH7A细胞）;IL-21+Nobiletin 25μM组（50ng/ml IL-21+25μmol/L Nobiletin处理MH7A细胞）;IL-21+Nobiletin 50μM组（50ng/ml IL-21+50μmol/L Nobiletin处理MH7A细胞）;MH7A细胞干预结束后,继续培养48小时后进行相关项目分析:细胞因子分析:ELISA检测各组细胞中IL-6、TNF-α、HMGB1、MMP-3、MMP-13表达浓度分析;各组MH7A细胞ROS（活性氧）检测;各组MH7A细胞4-HNE（4-羟基壬烯醛）检测;RT-PCR检测IL-21R、IL-6、TNF-α、MMP-3、MMP-13表达浓度分析;Western-blot检测IL-21R及JAK1/STAT3信号通路关键蛋白表达分析;统计数据,给出结论。结果:ELISA化学检测:IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;HMGB1蛋白:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;4-HNE检测:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;ROS检测:各组MH7A细胞中的ROS表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;RT-PCR检测:IL-21R:各组MH7A细胞m RNA表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;Westwen-blot检测:IL-21R:各组MH7A细胞蛋白浓度表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;JAK1/STAT3信号通路:各组MH7A细胞中JAK1、STAT3蛋白表达差异性较小,P>0.05,差异不具有统计学意义;在其磷酸的表达过程中,各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:（1）川陈皮素可以靶向IL-21受体对MH7A细胞做出免疫应答过程,明显降低MH7A滑膜细胞内白细胞介素以及基质金属蛋白酶等浓度变化,缓解MH7A滑膜细胞的炎性进展过程,促进其修复过程,且随着川陈皮素浓度增加,这种趋势更加明显。（2）川陈皮素可以靶向IL-21受体对细胞经典信号通路JAK1/STAT3进行调控应答,降低细胞信号通路关键蛋白JAK1及STAT3等蛋白的磷酸化水平,减缓炎症过程,与上文的结论具有一致性。由此可以得知,川陈皮素在类风湿关节炎的发生、发展过程中可能具有潜在的研究价值,为后期临床治疗类风湿关节炎提供靶向研究导向。第二部分:川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应体内研究目的:在体外研究的基础上,体内研究进一步探讨了川陈皮素靶向IL-21调控类风湿关节炎的免疫应答过程,从而明确了其与IL-21/IL-21R及JAK1/STAT3信号通路在调控过程中的介导关系,表明了川陈皮素在抗类风湿关节炎症作用方向的价值性,为后期临床治疗类风湿关节炎提供研究方向。材料与方法:选取48只Wistar大鼠适应性饲养1周后将其随机分成4组,除去对照组大鼠,其余建立CIA模型;具体分组如下:Control组（大鼠不做处理）;IL-21组（CIA模型+50 ng/ml IL-21,腹腔注射）;IL-21+Nobiletin 25μM组（CIA模型+50 ng/ml IL-21+25μmol/L Nobiletin,腹腔注射）;IL-21+Nobiletin 50μM组（CIA模型+50 ng/ml IL-21+50μmol/L Nobiletin,腹腔注射）;继续饲养6周后将大鼠处死,进行相关项目分析:各组大鼠模型成功率检测:大体观察、体重指数、关节炎、关节指数分析;形态学分析:各组大鼠HE染色分析;ELISA检测分析:IL-21R、TNF-α、IL-6、HMGB1、MMP-3及MMP-13蛋白;RT-PCR检测分析IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3及MMP-13m RNA表达分析;Western-blot检测分析IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3及MMP-13及JAK1/STAT3通路分析,分析数据,给出结论。结果:模型成功率检测:临床表现:对照组大鼠精神状态较好,体重体现出稳步增长的趋势,毛发光泽性较差;模型组大鼠意志沉迷,进食量逐渐减少,毛发光泽性,2周后处于无法负重的状态;体重变化:两周后各组大鼠的体重变化趋势为IL-21<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21+Nobiletin 50μM<Control,各组之间体重比较,差异具有统计学意义（P<0.05）;关节炎发病率/关节指数:各组关节炎发病率比较趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,数据分析差异具有统计学意义（P<0.05）.形态学分析:HE染色:对照组大鼠踝关节组织细胞排列密集,形态规则,轮裹明显;模型组大鼠踝关节组织细胞层变厚,白细胞和淋巴细胞大量充斥,连续性减弱;川陈皮素干预后,大鼠的踝关节组织细胞排列密集性加强,细胞形态趋于正常。ELISA化学检测:IL-6、TNF-α:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;HMGB1蛋白:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。RT-PCR检测:IL-21R:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。Westwen-blot检测:IL-21R:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;JAK1/STAT3信号通路:各组MH7A细胞中JAK1、STAT3蛋白表达差异性较小,P>0.05,差异不具有统计学意义;在其磷酸的表达过程中,表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:（1）川陈皮素可以较好的改善模型组大鼠关节炎效应,明显改善大鼠的精神状态,降低大鼠的类风湿关节炎症的程度及关节指数,为后续的研究提供帮助。（2）与体外研究结果一致,川陈皮素改善大鼠类风湿关节炎症的作用主要是通过靶向机体IL-21R浓度变化进而调控JAK1/STAT3的活性状态,充分降低白细胞介素、肿瘤坏死因子-α、高迁移率蛋白表达,逐渐恢复关节软骨基质合成及分解的平衡状态,加速类风湿关节炎疾病的康复过程,达到对类风湿关节炎的治疗效果,给予临床一定启发。
沈张飞[10]（2020）在《家蚕滞育信号转导的分子机理研究》文中指出滞育是昆虫为躲避寒冷等极端不良自然环境而进化出的一种个体发育停滞的生存策略。家蚕滞育受到家蚕滞育激素（Bombyx mori diapause hormone,BmDH）的调控。BmDH是由24个氨基酸组成的神经肽,通过特异性结合并激活家蚕滞育激素受体（Bombyxmori Diapause hormone receptor,BmDHR）而转导其信号,并最终诱导家蚕胚胎滞育。本论文对BmDHR的表达与特性、BmDH/BmDHR介导的MAPK/ERK信号通路、BmDH与BmDHR特异性结合的结构基础、以及家蚕CAPA受体信号通路和BmDH/BmDHR信号通路的交叉激活进行了研究,取得的主要结果如下:1、通过一系列细胞功能实验,研究BmDHR介导的具体信号转导通路。结果表明,BmDHR主要定位在细胞膜上,当被BmDH激活后,能与Gαq蛋白亚基偶联,导致细胞内Ca2+水平升高和cAMP响应元件驱动的荧光素酶反应活性显着增加,但不引起cAMP积累。2、BmDHR被BmDH激活后引起胞内ERK磷酸化并呈BmDH作用浓度和作用时间依赖性,Gαq抑制剂、PLC抑制剂、PKC抑制剂、Ca2+螯合剂、Gβγ抑制剂、PI3K抑制剂和MEK抑制剂对BmDHR介导的ERK磷酸化表现出显着的抑制作用。RTKs反式激活途径不影响BmDHR介导的ERK磷酸化。3、通过Cy5.5标记的BmDH竞争性结合试验、一系列关于BmDHR被激活后介导的下游信号转导通路的细胞功能实验以及蛋白质结构模拟,研究BmDH与BmDHR的特异性结合的结构基础。结果表明,BmDH的C端最后6位氨基酸（DH6）是其激活BmDHR所需的最少氨基酸残基,其中Arg23和Leu24对于BmDH与BmDHR的结合和激活是必不可少的,Trp19和Phe20也有助于BmDH介导 BmDHR 的功能活性;BmDHR 的 Glu89、Phe172、Phe194 和 Tyr299 位点在BmDHR与BmDH发生结合以及介导下游信号转导通路中起到重要作用;BmDH的C端6个氨基酸残基结合到由BmDHR的N端、ECL1、ECL2、ECL3、TM2、TM3 和 TM5-TM7 包围的口 袋中,BmDHR 上 TM3 的 Cys 106 位点和 ECL2的Cys183位点之间的二硫键锚定ECL2,用于与BmDH的结合。4、在 Bm-CAPA-PVK-1 或-PVK-2 刺激下,Bm-CAPA-PVK-R2 显着增加细胞内cAMP响应元件控制的萤光素酶活性和Gαq蛋白依赖的Ca2+水平,并引起胞内ERK磷酸化,其效应均呈现Bm-CAPA-PVK-1或-PVK-2作用浓度和作用时间依赖性;ERK磷酸化可以被Gq抑制剂、PLC抑制剂、PKC抑制剂、PLD抑制剂、Ca2+螯合剂、Gβγ抑制剂、PI3K抑制剂和Src抑制剂显着抑制,并且受到酪氨酸蛋白激酶（Receptor Tyrosine Kinase,RTK）的转激活途径调控。β-arrestin1/2不调控Bm-CAPA-PVK-R2介导的ERK磷酸化,但参与ERK磷酸化依赖的受体内吞。此外发现Bm-CAPA-PK可以激活BmDHR介导的下游信号转导通路,BmDH也可以激活Bm-CAPA-PVK-R1Δ341（BNGR-A25S）介导的下游信号转导通路。本研究阐明了 BmDHR被激活后介导的下游信号转导通路以及BmDH/BmDHR结合的结构基础,并且发现家蚕CAPA/CAPA受体信号转导通路与BmDH/BmDHR信号转导通路间存在交叉激活反应。研究结果为全面解明家蚕胚胎滞育的分子机理做出了贡献,也为后续进一步研究其他不同昆虫滞育机制研究提供了新思路。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 黄韧带肥厚的机制及动物模型建立的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 TGF-β1/Smads信号通路与纤维化 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本收集 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 影像学测量 |
| 1.4 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.5 手术方式 |
| 1.6 标本的取材、运输等标准操作规程 |
| 1.7 HE染色与组织形态学观察 |
| 1.8 Masson染色与纤维化观察 |
| 1.9 免疫组化法检测两组黄初带IL-lp、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1和Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.10 实时焚光聚合酶链式反应（Real-Time PCR)检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3&mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 HE染色结果 |
| 2.3 Masson染色结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 Real-Time PCR结果 |
| 2.6 DLSS组内黄韧带厚度和各层纤维化分级的相关性分析 |
| 2.7 DLSS组内黄韧带厚度和各层弹性-胶原纤维比的相关性分析 |
| 2.8 DLSS组内黄韧带厚度和各层mRNA表达的相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 炎症与纤维化是黄韧带肥厚的主要病理机制 |
| 3.2 黄韧带背侧层是退变的起点 |
| 3.3 基于“阳化气,阴成形”理论探讨黄韧带“炎症-纤维化”病理过程 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨DLSS的中医药治疗 |
| 3.5 其他 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.3 实验动物的分组与取材 |
| 1.4 实验动物的造模 |
| 1.5 影像学测量 |
| 1.6 HE染色与大鼠黄韧带厚度的测量 |
| 1.7 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化观察 |
| 1.8 免疫组化法检测各组黄初带IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1、Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.9 免疫印迹法定性、半定量分析IL-1β、TNF-α、TGF-β1和Coll蛋白在各组黄韧带内表达 |
| 1.10 Real-Time PCR检测 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3的mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HE染色与大鼠黄韧带厚度的结果 |
| 2.2 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化的结果 |
| 2.3 影像学测量结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 免疫印迹结果 |
| 2.6 Real-Time PCR结果 |
| 2.7 大鼠黄韧带与人增厚黄韧带的比较 |
| 2.8 模型成功率 |
| 3 讨论 |
| 3.1 大鼠黄韧带肥厚模型的建立方法 |
| 3.2 大鼠黄韧带肥厚的病理表现 |
| 3.3 机械应力是诱发或加速黄韧带肥厚的重要因素 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨大鼠黄韧带增厚模型的建立 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 不足与展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 选题背景及意义 |
| 1.2 BCAS1在人左脑认知中网络研究现状 |
| 1.3 材料和方法 |
| 1.4 本文结构安排 |
| 第二章 BCAS1知识网络 |
| 2.1 BCAS1上游激活知识网络 |
| 2.2 BCAS1反馈激活知识网络 |
| 2.3 BCAS1下游激活知识网络 |
| 2.4 BCAS1上游抑制知识网络 |
| 2.5 BCAS1反馈抑制知识网络 |
| 2.6 BCAS1下游抑制知识网络 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 BCAS1分子网络构建 |
| 3.1 BCAS1上游激活分子网络 |
| 3.2 BCAS1反馈激活分子网络 |
| 3.3 BCAS1下游激活分子网络 |
| 3.4 BCAS1上游抑制分子网络 |
| 3.5 BCAS1反馈抑制分子网络 |
| 3.6 BCAS1下游抑制分子网络 |
| 3.7 本章小结 |
| 第四章 BCAS1网络系统分析 |
| 4.1 BCAS1的激活串机制分析 |
| 4.1.1 癌症通路 |
| 4.1.2 酶结合 |
| 4.1.3 聚(A) RNA结合 |
| 4.1.4 RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调节 |
| 4.2 BCAS1的激活和抑制共存串机制分析 |
| 4.2.1 MAPK信号传转导通路 |
| 4.2.2 血管内皮生长因子受体信号转导通路 |
| 4.2.3 Fcε受体信号转导通路 |
| 4.2.4 小GTP酶介导的信号转导 |
| 4.2.5 结构分子活性 |
| 4.2.6 蛋白激酶结合 |
| 4.2.7 ATP结合 |
| 4.2.8 未折叠的蛋白质结合 |
| 4.2.9 DNA模板化转录的调节 |
| 4.2.10 胞液 |
| 4.2.11 内吞作用 |
| 4.2.12 凋亡过程的负调节 |
| 4.2.13 血小板活化 |
| 4.2.14 凋亡过程的正调节 |
| 4.3 BCAS1的抑制串机制分析 |
| 4.3.1 大脑发育 |
| 4.3.2 细胞周期 |
| 4.3.3 肽基丝氨酸磷酸化 |
| 4.3.4 蛋白激酶活性 |
| 4.3.5 蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 芪龙胶囊的研究进展 |
| 1.1 芪龙胶囊组成与功效 |
| 1.2 芪龙胶囊药理与毒理 |
| 1.3 芪龙胶囊的临床研究 |
| 2 缺血性中风病的研究进展 |
| 2.1 缺血性中风的临床流行病学特征 |
| 2.2 动脉粥样硬化及其相关信号通路与生物过程 |
| 2.3 西医对缺血性中风的治疗现状 |
| 2.4 中医对缺血性中风的认识与治疗 |
| 3 队列研究与混杂因素的处理方法 |
| 3.1 前瞻性队列研究与混杂控制 |
| 3.2 差值检验法与倾向性评分匹配法 |
| 4 重复测量数据的分析方法 |
| 4.1 重复测量数据定义与常见分析模型 |
| 4.2 对齐秩转换方差分析与广义线性混合模型 |
| 5 转录组测序与RT-qPCR技术 |
| 5.1 转录组学与常见研究方法 |
| 5.2 RNA-Seq与RT-qPCR技术 |
| 5.3 基于RNA-Seq与RT-qPCR技术的中药复方疗效机制研究探索 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第二部分 芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风病的前瞻性队列研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 研究设计 |
| 2.2 研究人群 |
| 2.3 受试者来源 |
| 2.4 暴露因素 |
| 2.5 随访内容与随访时点 |
| 2.6 结局指标 |
| 2.7 样本量计算 |
| 2.8 生物样本采集 |
| 2.9 知情同意、伦理与国际注册 |
| 2.10 质量控制与数据管理 |
| 2.11 数据预处理与统计方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 队列建立流程图 |
| 3.2 招募与纳入分析情况 |
| 3.3 全数据集基线特征 |
| 3.4 基础治疗情况 |
| 3.5 全数据集差值检验分析结果 |
| 3.6 PSM子数据集基线特征 |
| 3.7 子数据集差值检验分析结果 |
| 3.8 子数据集对齐秩转换方差分析结果 |
| 3.9 广义线性混合模型分析结果 |
| 3.10 安全性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 研究的主要发现 |
| 4.2 研究的优势与不足 |
| 4.3 临床应用与未来研究的指导意义 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于RNA-Seq高通量测序的芪龙胶囊干预后差异表达mRNA研究 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验血样 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 实验分组 |
| 3.2 总RNA提取 |
| 3.3 总RNA质控 |
| 3.4 文库构建与测序 |
| 3.5 测序数据的过滤和质控 |
| 3.6 数据分析与统计 |
| 4 结果 |
| 4.1 总RNA纯度和完整性测定结果 |
| 4.2 测序数据结果 |
| 4.3 基因表达量分析结果 |
| 4.4 差异基因分析结果 |
| 4.5 差异基因功能富集结果 |
| 5 讨论 |
| 5.1 转录组测序技术在中药复方作用机制研究中的适用性 |
| 5.2 实验血样总RNA质量与测序数据质量 |
| 5.3 实验各组显着差异基因与功能富集 |
| 5.4 芪龙胶囊调控的主要差异基因及信号通路与生物过程 |
| 参考文献 |
| 第四部分 基于RT-qPCR的芪龙胶囊干预后关键基因与调控机制研究 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验分组 |
| 3 实验材料 |
| 3.1 实验试剂 |
| 3.2 实验仪器 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 样本总RNA提取 |
| 4.2 样本总RNA质检 |
| 4.3 mRNA逆转录 |
| 4.4 实时荧光定量PCR扩增 |
| 4.5 统计分析 |
| 5 实验结果 |
| 5.1 总RNA质量检测结果 |
| 5.2 扩增曲线及溶解曲线 |
| 5.3 两组间目标基因相对表达量比较 |
| 6 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 查新报告 |
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 观察肾衰饮对CRF大鼠抗炎、抗凋亡的作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 基于TLR4/MyD88/NF-κB通路探讨肾衰饮对CRF大鼠抗炎机制的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 肾衰饮对CRF大鼠肾脏细胞凋亡的调控机制 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文四 探讨肾衰饮调控CRF大鼠PI3K/Akt通路的作用机制 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 从炎症及细胞凋亡角度探讨CRF的发病机制及中药防治CRF的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 附录:缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 EGFR酪氨酸激酶抑制剂对骨肉瘤生物学活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 EGFR在不同OS细胞和成骨细胞中表达 |
| 2 吉非替尼对OS细胞增殖的影响 |
| 3 吉非替尼对OS细胞移植瘤生长的影响 |
| 4 吉非替尼对OS细胞迁移和侵袭的影响 |
| 5 吉非替尼对OS细胞凋亡的影响 |
| 6 吉非替尼对OS细胞周期的影响 |
| 7 吉非替尼对OS细胞生物学特性影响的相关机制 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 EGFR沉默表达对骨肉瘤生物学活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 EGFR慢病毒干扰对OS细胞EGFR表达的影响 |
| 2 EGFR沉默表达对OS细胞增殖的影响 |
| 3 EGFR沉默表达对OS细胞移植瘤生长的影响 |
| 4 EGFR沉默表达对OS细胞迁移和侵袭的影响 |
| 5 EGFR沉默表达对OS细胞凋亡的影响 |
| 6 EGFR沉默表达对OS细胞周期的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 Stattic对吉非替尼介导的骨肉瘤生物学活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 EGFR蛋白与STAT3 蛋白之间的相互作用 |
| 2 Stattic对吉非替尼介导的OS细胞增殖抑制的影响 |
| 3 Stattic对吉非替尼介导的OS细胞移植瘤生长抑制的影响 |
| 4 Stattic对吉非替尼介导的OS细胞迁移和侵袭抑制的影响 |
| 5 Stattic对吉非替尼介导的OS细胞凋亡促进的影响 |
| 6 Stattic对吉非替尼介导的OS细胞周期变化的影响 |
| 7 Stattic对吉非替尼介导的OS细胞活性变化影响的相关机制 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 Stattic对 EGFR沉默表达介导的骨肉瘤生物学活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 Stattic对 EGFR沉默表达介导的OS细胞增殖抑制的影响 |
| 2 Stattic对 EGFR沉默表达介导的OS细胞迁移和侵袭抑制的影响 |
| 3 Stattic对 EGFR沉默表达介导的OS细胞凋亡促进的影响 |
| 4 Stattic对 EGFR沉默表达介导的OS细胞周期变化的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 肝细胞生长因子受体在骨肉瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 文献综述 TGF-β1相关通路在乙肝后肝纤维化方面研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 网络药理学研究 |
| 第一节 资料与方法 |
| 1 活血软坚扶正方活性化学成分与作用靶点的获取和筛选 |
| 2 乙肝后肝纤维化相关作用靶点的筛选 |
| 3 药物-活性成分-疾病相关靶点网络的构建 |
| 4 蛋白相互作用网络的构建与核心靶标筛选 |
| 5 生物过程与信号通路富集分析 |
| 第二节 活血软坚扶正方网络药理学研究结果 |
| 1 活血软坚扶正方活性成分的筛选 |
| 2 疾病相关靶点预测 |
| 3 药物-活性成分-疾病相关靶点网络构建 |
| 4 蛋白相互作用网络的构建与核心靶标筛选 |
| 5 GO基因功能富集分析 |
| 6 KEGG通路富集分析 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 活血软坚扶正方有效活性成分讨论 |
| 2 活血软坚扶正方抗乙肝后肝纤维化相关靶标蛋白讨论 |
| 3 活血软坚扶正方抗乙肝后肝纤维化相关信号通路讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 临床研究 |
| 第一节 资料与方法 |
| 1 一般资料 |
| 2 诊断标准 |
| 3 纳入标准 |
| 4 排除标准 |
| 5 退出标准 |
| 6 剔除标准 |
| 7 中止标准 |
| 8 治疗方法 |
| 9 观察指标 |
| 10 统计学方法 |
| 第二节 研究结果 |
| 1 基线情况 |
| 2 疗效比较 |
| 3 安全性指标检测 |
| 4 脱落病例分析 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 讨论 |
| 2 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 病态窦房结综合征研究现状 |
| 1.1.1 病态窦房结综合征的发病机制研究 |
| 1.1.2 SSS的分型与临床表现 |
| 1.1.3 SSS的西医治疗 |
| 1.1.4 SSS的中医学研究现状 |
| 1.2 麻黄附子细辛汤研究现状 |
| 1.2.1 麻黄附子细辛汤的现代药理作用研究 |
| 1.2.2 麻黄附子细辛汤在SSS治疗中的应用 |
| 1.3 网络药理学简介及其在中医药研究中的应用 |
| 1.3.1 网络药理学概述 |
| 1.3.2 网络药理学常用数据库及研究方法 |
| 1.3.3 网络药理学与中医药研究 |
| 第二章 基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制 |
| 2.1 数据收集与研究方法 |
| 2.1.1 流程图 |
| 2.1.2 数据收集 |
| 2.1.3 网络构建与分析 |
| 2.1.4 分子对接验证 |
| 2.1.5 靶点通路注释分析 |
| 2.2 研究结果 |
| 2.2.1 构建麻黄附子细辛汤化学成分及潜在靶点数据集 |
| 2.2.2 构建SSS相关的疾病靶点数据集 |
| 2.2.3 麻黄附子细辛汤化学成分潜在靶点与SSS相关靶点的交集基因 |
| 2.2.4 麻黄附子细辛汤-化学成分-靶点-SSS网络及显效成分 |
| 2.2.5 麻黄附子细辛汤治疗SSS的关键化学成分和核心靶点 |
| 2.2.6 分子对接结果 |
| 2.2.7 靶点通路注释分析 |
| 2.3 分析与结论 |
| 2.3.1 麻黄附子细辛汤治疗SSS的显效成分分析 |
| 2.3.2 麻黄附子细辛汤治疗SSS的关键成分和核心靶点分析 |
| 2.3.3 靶点通路注释分析 |
| 2.3.4 结论 |
| 2.3.5 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 术语与缩略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 农药残留及免疫检测技术发展现状 |
| 1.2 农药小分子特异性单克隆抗体研究进展 |
| 1.3 杂交瘤细胞技术 |
| 1.4 杂交瘤细胞识别特异性基础——B淋巴细胞 |
| 1.5 CRISPR/Cas基因编辑在杂交瘤细胞生物学研究中的应用 |
| 1.5.1 基因编辑技术概况 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas系统结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas系统机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9基因编辑原理 |
| 1.5.5 CRISPR/Cas9基因编辑文库 |
| 1.5.6 CRISPR/Cas9系统及文库在抗体基因编辑上的应用 |
| 1.6 研究内容及预期目标 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 预期目标 |
| 1.6.3 研究技术路线 |
| 第2章 杂交瘤细胞株及抗百菌清单抗表型的多样性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与设备 |
| 2.2.1.1 试剂材料 |
| 2.2.1.2 试剂盒 |
| 2.2.1.3 仪器设备 |
| 2.2.1.4 培养液及缓冲液配方 |
| 2.2.1.5 试验动物 |
| 2.2.2 农药特异性杂交瘤细胞筛选及单克隆抗体制备 |
| 2.2.2.1 动物免疫 |
| 2.2.2.2 小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)及饲养细胞的准备 |
| 2.2.2.3 细胞融合 |
| 2.2.2.4 阳性杂交瘤单克隆细胞株筛选 |
| 2.2.3 腹水单抗制备与表征 |
| 2.2.3.1 小鼠腹水单抗制备 |
| 2.2.3.2 腹水单抗灵敏度测定 |
| 2.2.3.3 腹水单抗轻重链类型测定 |
| 2.2.4 不同农药特异性杂交瘤细胞株不同处理后阴性率统计 |
| 2.2.5 杂交瘤细胞株抗体分泌FACS分析 |
| 2.2.6 阴阳性单克隆杂交瘤细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.2.7 BJQ单克隆杂交瘤细胞株抗体产生情况表征 |
| 2.2.7.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.2.7.2 BJQ杂交瘤细胞不同生长阶段Ig G分泌表征 |
| 2.2.7.3 杂交瘤细胞胞内总蛋白提取及浓度测定 |
| 2.2.7.4 胞内蛋白抗体亲和特异性检测 |
| 2.2.7.5 胞内蛋白Ig G定量 |
| 2.2.7.6 胞内蛋白抗体轻重链类型鉴定 |
| 2.2.7.7 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 阳性单克隆杂交瘤细胞株筛选及腹水单抗表征 |
| 2.3.2 单克隆杂交瘤细胞株阴性率测定 |
| 2.3.3 抗体分泌情况FACS分析 |
| 2.3.4 各农药阴阳性细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.3.5 BJQ单克隆细胞周期及抗体表达表征 |
| 2.3.5.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.3.5.2 BJQ阳性细胞株E2生长阶段与Ig G分泌 |
| 2.3.5.3 胞内蛋白的抗体特异性鉴定 |
| 2.3.5.4 胞内蛋白IgG定量 |
| 2.3.5.5 胞内蛋白抗体轻重链类型表征 |
| 2.3.5.6 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与设备 |
| 3.2.1.1 试剂材料 |
| 3.2.1.2 仪器设备 |
| 3.2.1.3 主要缓冲液 |
| 3.2.1.4 实验材料 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞测序 |
| 3.2.2.1 杂交瘤细胞总RNA提取 |
| 3.2.2.2 5’RACE反转录及PCR扩增抗体轻重链可变区序列 |
| 3.2.2.3 抗体基因克隆及Sanger测序 |
| 3.2.3 HEK293(F)重组全抗体瞬时表达 |
| 3.2.3.1 质粒提取 |
| 3.2.3.2 瞬时表达质粒构建及验证 |
| 3.2.3.3 重组全抗体瞬时表达及纯化 |
| 3.2.3.4 瞬时表达重组抗体表征 |
| 3.2.4 HEK293重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.1 构建慢病毒表达载体 |
| 3.2.4.2 慢病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.4.3 重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.4 稳定表达重组抗体表征 |
| 3.2.5 杂交瘤细胞株免疫组库测序及分析 |
| 3.2.6 杂交瘤细胞转录组测序及生物信息分析 |
| 3.2.6.1 转录组测序 |
| 3.2.6.2 转录组数据生物信息分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 杂交瘤细胞测序 |
| 3.3.1.1 总RNA的提取 |
| 3.3.1.2 特异性PCR产物分析 |
| 3.3.2 百菌清重组抗体瞬时表达 |
| 3.3.2.1 瞬时表达载体构建及验证 |
| 3.3.2.2 重组抗体瞬时表达及纯化表征 |
| 3.3.3 百菌清重组抗体稳定表达 |
| 3.3.3.1 不同表达质粒和表达体系稳定表达重组抗体效果表征 |
| 3.3.3.2 腹水抗体以及瞬时/稳定表达的重组抗体亲和性表征 |
| 3.3.4 BJQ杂交瘤细胞株免疫组库测序 |
| 3.3.5 BJQ阴阳性细胞转录组学测序及分析 |
| 3.3.5.1 RNA样品检测结果 |
| 3.3.5.2 测序数据过滤及测序质量分析 |
| 3.3.5.3 参考基因组比对 |
| 3.3.5.4 样品组间相关性 |
| 3.3.5.5 杂交瘤细胞株抗体基因表达分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 抗百菌清单抗表达差异的杂交瘤细胞株转录组分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与设备 |
| 4.2.1.1 试剂材料 |
| 4.2.1.2 仪器设备 |
| 4.2.1.3 实验材料 |
| 4.2.2 转录组差异表达基因筛选及GO/KEGG富集 |
| 4.2.3 qPCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.2.3.1 RNA提取 |
| 4.2.3.2 cDNA合成 |
| 4.2.3.3 qPCR反应 |
| 4.2.4 RNA干扰 |
| 4.2.4.1 基因siRNA片段设计 |
| 4.2.4.2 siRNA转染条件优化 |
| 4.2.4.3 RNA基因干扰 |
| 4.2.4.4 qPCR验证RNAi效果 |
| 4.2.4.5 流式分析RNAi杂交瘤细胞抗体分泌情况 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 差异表达基因分析 |
| 4.3.2 差异基因GO富集分析 |
| 4.3.3 差异基因KEGG富集分析 |
| 4.3.4 显着差异表达基因分析 |
| 4.3.5 qPCR验证转录组数据 |
| 4.3.6 RNAi验证基因功能 |
| 4.3.6.1 siRNA转染效率优化 |
| 4.3.6.2 RNA干扰功能基因表达及抗体分泌 |
| 4.3.7 杂交瘤细胞抗体表达途径及转阴可能因素 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第5章 CRISPR/Cas9文库筛选杂交瘤细胞抗体表达的功能基因 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.2.3 文库质粒扩增 |
| 5.2.4 慢病毒包装 |
| 5.2.4.1 去内毒素质粒中提 |
| 5.2.4.2 慢病毒包装 |
| 5.2.4.3 慢病毒滴度测定 |
| 5.2.5 杂交瘤细胞慢病毒文库感染 |
| 5.2.5.1 细胞准备 |
| 5.2.5.2 嘌呤霉素筛选浓度优化 |
| 5.2.5.3 慢病毒感染效率测定 |
| 5.2.6 GeCKO慢病毒文库感染E2细胞株 |
| 5.2.7 农药压力筛选 |
| 5.2.7.1 筛选原理 |
| 5.2.7.2 百菌清农药对杂交瘤细胞致死效应及抗体“中和作用” |
| 5.2.7.3 百菌清农药筛选浓度优化 |
| 5.2.7.4 百菌清农药筛选GeCKOv2E2细胞文库 |
| 5.2.8 流式细胞分选 |
| 5.2.8.1 分选原理 |
| 5.2.8.2 流式细胞分选 |
| 5.2.9 NGS扩增子测序 |
| 5.2.9.1 基因组DNA提取 |
| 5.2.9.2 特异性PCR |
| 5.2.9.3 NGS扩增子测序及数据分析 |
| 5.2.10 sh RNA功能基因验证 |
| 5.2.10.1 shRNA慢病毒质粒构建及慢病毒包装 |
| 5.2.10.2 shRNA慢病毒感染 |
| 5.2.10.3 qPCR验证基因功能 |
| 5.2.10.4 FACS检测杂交瘤细胞抗体表达情况 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 GeCKOv2 library质粒扩增 |
| 5.3.2 GeCKO library慢病毒包装与检测 |
| 5.3.3 杂交瘤细胞慢病毒文库构建 |
| 5.3.3.1 puro筛选浓度优化 |
| 5.3.3.2 慢病毒感染效率测定 |
| 5.3.3.3 GeCKOv2 E2 library慢病毒敲除文库构建 |
| 5.3.4 百菌清农药压力筛选 |
| 5.3.4.1 百菌清农药对杂交瘤细胞的毒性作用 |
| 5.3.4.2 特异性单抗对百菌清农药的“中和作用” |
| 5.3.4.3 百菌清农药筛选时间及浓度优化 |
| 5.3.4.4 百菌清农药筛选GeCKO v2 E2细胞文库 |
| 5.3.5 流式细胞分选 |
| 5.3.6 农药压力筛选NGS扩增子测序分析 |
| 5.3.6.1 核酸样品质控 |
| 5.3.6.2 测序数据质控 |
| 5.3.6.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.6.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.6.5 样品间相似性分析 |
| 5.3.6.6 显着富集基因分析 |
| 5.3.6.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.6.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.6.9 药筛富集的功能基因、通路与转录组比对分析 |
| 5.3.7 流式细胞分选测序结果分析 |
| 5.3.7.1 核酸样品质控 |
| 5.3.7.2 测序数据质控 |
| 5.3.7.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.7.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.7.5 样本间相似性分析 |
| 5.3.7.6 显着差异基因分析 |
| 5.3.7.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.7.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.7.9 CRISPR library流式筛选及药物筛选功能基因通路与RNA-seq比对分析 |
| 5.3.8 shRNA干扰验证功能基因 |
| 5.3.8.1 shRNA慢病毒感染效率优化 |
| 5.3.8.2 qPCR验证干扰基因及抗体基因表达情况 |
| 5.3.8.3 FACS检测抗体表达情况 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第6章 百菌清抗原免疫小鼠脾脏细胞转录组学分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 转录组测序与生物信息分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 脾脏转录组RNA样品检测结果 |
| 6.3.2 脾脏转录组测序数据过滤及测序质量分析 |
| 6.3.3 脾脏转录组数据参考基因组比对 |
| 6.3.4 基因表达分析及显着性DEG筛选 |
| 6.3.5 差异基因GO富集分析 |
| 6.3.6 差异基因KEGG富集分析 |
| 6.3.7 显着差异基因分析 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 第7章 抗百菌清杂交瘤细胞抗体表达的调控途径及分子机制探究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 BJQ特异性杂交瘤细胞株及其单抗的多样性分析 |
| 7.2.1 杂交瘤细胞株及其单抗表型的多样性分析 |
| 7.2.1.1 阴阳性单克隆杂交瘤细胞的定义 |
| 7.2.1.2 不同处理方式测定杂交瘤细胞株阴性率 |
| 7.2.1.3 杂交瘤细胞增殖及抗体分泌情况 |
| 7.2.1.4 流式分析杂交瘤细胞抗体分泌情况及抗体亚型检测 |
| 7.2.1.5 BJQ杂交瘤细胞株抗体产生情况分析 |
| 7.2.2 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 7.2.2.1 BJQ特异性杂交瘤细胞抗体序列测定及验证 |
| 7.2.2.2 BJQ阴阳性细胞及SP2/0 细胞免疫组库测序 |
| 7.2.2.3 BJQ五株阴阳性细胞及SP2/0 细胞抗体基因表达情况 |
| 7.3 BJQ特异性抗体表达差异的杂交瘤细胞株转录组学分析 |
| 7.3.1 DEG筛选及RNA-seq可靠性验证 |
| 7.3.2 GO功能及KEGG通路富集分析 |
| 7.3.3 差异表达基因分析 |
| 7.3.4 RNAi相关功能基因分析 |
| 7.4 CRISPR文库筛选杂交瘤细胞抗体表达相关基因及通路分析 |
| 7.4.1 GeCKO文库质粒扩增及慢病毒包装 |
| 7.4.2 慢病毒文库感染杂交瘤细胞 |
| 7.4.3 农药压力筛选与流式细胞分选 |
| 7.4.4 NGS扩增子测序数据分析 |
| 7.4.5 差异基因与功能通路富集分析 |
| 7.4.6 shRNA验证Pet2基因和Ccnd2基因功能 |
| 7.5 BJQ杂交瘤细胞转录组与CRISPR library筛选综合分析 |
| 7.5.1 转录组与CRISPR library筛选方法比较 |
| 7.5.2 两种筛选方式共同富集的基因功能及信号通路 |
| 7.5.3 两种筛选方式共同富集的差异基因分析 |
| 7.5.4 杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.6 骨髓瘤细胞SP2/0 与杂交瘤细胞功能基因表达差异分析 |
| 7.7 百菌清农药抗原免疫小鼠脾细胞各阶段转录组分析 |
| 7.7.1 研究对象的选择 |
| 7.7.2 转录组基因表达分析及差异基因筛选 |
| 7.7.3 脾脏转录组显着差异基因GO/KEGG富集分析 |
| 7.7.4 小鼠机体产生抗BJQ特异性抗体的过程 |
| 7.7.5 杂交瘤细胞与机体B细胞抗体合成途径异同 |
| 7.8 抗百菌清特异性单抗合成及分泌途径及调控机制 |
| 7.8.1 杂交瘤细胞的融合与体外培养 |
| 7.8.2 杂交瘤细胞抗体基因编码与表达 |
| 7.8.2.1 DNA编码水平 |
| 7.8.2.2 表观遗传学编码水平 |
| 7.8.2.3 杂交瘤细胞抗体基因表达调控 |
| 7.8.3 杂交瘤细胞周期进程调控 |
| 7.8.4 信号通路与转录因子调控杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.8.5 杂交瘤细胞抗体基因转录后调控 |
| 7.8.6 杂交瘤细胞抗体装配与修饰 |
| 7.8.7 杂交瘤细胞抗体运输及分泌 |
| 7.8.8 杂交瘤细胞调控抗体合成及分泌的相关机制 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 全文总结 |
| 8.2 全文创新点 |
| 8.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1.类风湿关节炎 |
| 1.1 疾病介绍 |
| 1.2 滑膜成纤维细胞代谢与类风湿关节炎 |
| 1.3 细胞因子与类风湿关节炎 |
| 2.IL-21/IL-21R信号转导途径 |
| 2.1 IL-21/IL-21R产生及来源 |
| 2.2 IL-21/IL-21R对疾病的调节 |
| 2.3 IL-21/IL-21R与类风湿关节炎 |
| 3.JAK/STAT信号通路与类风湿关节炎 |
| 3.1 JAK/STAT信号通路 |
| 3.2 基本过程及调节 |
| 3.3 JAK/STAT与类风湿关节炎 |
| 4.川陈皮素药理性作用 |
| 4.1 名称介绍 |
| 4.2 药代动力学 |
| 4.3 药理作用 |
| 5.本研究的目的和内容 |
| 第一部分 :川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎炎症反应体外研究 |
| 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及设备 |
| 1.3 实验过程 |
| 1.4 实验分析 |
| 1.5 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 川陈皮素对MH7A细胞活力的影响 |
| 2.2 川陈皮素能够抑制IL-21受体的表达 |
| 2.3 川陈皮素抑制IL-21诱导的氧化应激反应 |
| 2.4 川成皮素抑制促炎细胞因子的表达 |
| 2.5 川陈皮素抑制IL-21 诱导的基质金属蛋白酶(MMPs)表达 |
| 2.6 川陈皮素的作用通过JAK1/STAT3 信号通路介导 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 第二部分 :川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎炎症反应体内研究 |
| 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及设备 |
| 1.3 实验试剂配置 |
| 1.4 实验过程 |
| 1.5 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 模型成功率检测 |
| 2.2 形态学分析表明川陈皮素对类风湿关节炎的改善作用 |
| 2.3 ELISA检测IL-21R、TNF-α、IL-6、HMGB1、MMP-3及MMP-13 提示川陈皮素对类风湿关节炎炎症的的抑制效应 |
| 2.4 RT-PCR检测IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13从m RNA水平进一步表明川陈皮素抑制类风湿关节炎炎症的水平 |
| 2.5 Western-blot检测IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13、JAK1/STAT3从蛋白水平进一步充分表明川陈皮素的类风湿关节炎炎症抑制作用 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 综述 白细胞介素21在类风湿关节炎中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 缩写词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 家蚕滞育激素 |
| 1.2.1 家蚕滞育激素的发现与结构 |
| 1.2.2 家蚕滞育激素的编码基因与表达 |
| 1.2.3 家蚕滞育激素的功能 |
| 1.3 家蚕滞育激素受体 |
| 1.3.1 家蚕滞育激素受体基因的克隆与表达 |
| 1.3.2 家蚕滞育激素受体信号转导 |
| 1.4 昆虫CAPA神经肽和CAPA受体 |
| 1.4.1 昆虫CAPA神经肽 |
| 1.4.2 昆虫CAPA受体的细胞信号转导 |
| 1.5 前景展望 |
| 1.6 本研究的目的意义、研究内容和技术路线 |
| 1.6.1 研究的目的和意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第二章 家蚕滞育激素受体的表达和特性鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂与耗材 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 家蚕滞育激素受体在细胞中的定位与表达 |
| 2.3.2 家蚕滞育激素受体被激活后引发依赖Gαq蛋白的胞内Ca~(2+)流变化 |
| 2.3.3 家蚕滞育激素受体被激活后只偶联Gαq亚基蛋白 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 家蚕滞育激素受体介导MAPK/ERK信号通路的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试剂与耗材 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 家蚕滞育激素受体被激活后介导MAPK/ERK通路 |
| 3.3.2 家蚕滞育激素受体介导的ERK磷酸化信号需要Gαq和Gβγ亚基 |
| 3.3.3 磷脂酶C/蛋白激酶C和Ca~(2+)路径参与家蚕滞育激素受体被激活后介导的ERK磷酸化 |
| 3.3.4 PI3K参与家蚕滞育激素受体介导的ERK磷酸化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 家蚕滞育激素与受体特异性结合的结构基础 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂与耗材 |
| 4.2.2 主要仪器与设备 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 家蚕滞育激素激活家蚕滞育激素受体最少需要C端保留6个氨基酸 |
| 4.3.2 家蚕滞育激素最后6个氨基酸中介导信号活性的关键位点 |
| 4.3.3 家蚕滞育激素与家蚕滞育激素受体形成的复合体结构 |
| 4.3.4 家蚕滞育激素与家蚕滞育激素受体的相互作用 |
| 4.3.5 家蚕滞育激素受体上与家蚕滞育激素相互作用的关键氨基酸位点 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 家蚕CAPA受体信号转导和家蚕滞育激素及其受体的交叉激活反应 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂与耗材 |
| 5.2.2 主要仪器与设备 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 家蚕CAPA受体在配体作用下以家蚕滞育激素受体类似方式介导激活MAPK/ERK信号通路 |
| 5.3.2 配体刺激内吞的CAPA-PVK-R2会再回膜或被溶酶体降解 |
| 5.3.3 胞内磷酸化后的ERK蛋白会通过β-arrestin1/2蛋白延迟诱导无配体刺激条件下细胞膜上的受体发生内吞 |
| 5.3.4 家蚕CAPA及其受体与家蚕滞育激素及其受体的交叉激活反应 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 特色与创新 |
| 6.3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 表达载体构建所需引物 |
| 附录二 pBmIE1-FLAG和pBmIE1-EGFP质粒图谱 |
| 作者简介及博士在读期间取得的科研成果 |
