董雪田,朱恺丽,曲音波,杨培龙,余晓斌,罗玮[1]（2021）在《一种快速提取三孢布拉霉基因组的方法》文中研究指明三孢布拉霉负菌是一种重要的β-胡萝卜素和番茄红素工业生产菌株,由于其基因组提取耗时费力,转化子筛选困难,基因编辑工作严重受阻。作者比较了煮沸法、添加NaOH煮沸法、复合酶液（2 g/dL溶壁酶+3 g/dL纤维素酶+3 g/dL蜗牛酶）酶解法、复合酶液酶解后煮沸法等4种处理方法的效果,发现NaOH为影响三孢布拉霉基因组释放的关键因素;对NaOH浓度、煮沸时间及基因组源的选择（上清液或处理后的菌苔）进行了优化,当NaOH浓度不低于20 mmol/L时,所处理样品的上清液均可扩增出目的基因,煮沸时间对基因组的释放无影响;不同浓度NaOH处理条件下基因组的稳定性实验表明,在所测时间（最长至108 h）内,基因组质量浓度（150～350 ng/μL）与纯度(OD260/OD2801.8～2.0)均较高,且随时间的延长无明显下降趋势;以快速提取法与常规提取法获得的基因组为模板进行PCR,两种方法扩增结果无明显差异,后续对PCR产物的测序与酶切实验证明了NaOH处理不会对后续实验产生影响;最后,从扩增同一菌株不同基因和不同丝状真菌ITS两个方面确定了基因组快速提取方法具有一定的普适性。
王少伟[2]（2021）在《稻瘟菌MoPTEN基因及禾谷炭疽菌CgPTPM1基因的生物功能研究》文中进行了进一步梳理植物病原真菌每年都会对全球的粮食产量和食品安全造成极大的危害。作为其重要组成类型的半活体营养型病原菌在造成植物发病的过程中危害巨大。半活体营养真菌所经历的活体营养和死体营养两个阶段也暗示其在对营养的利用和对宿主的侵染过程中有着更加宽泛的选择,同时也有着较多的调控路径。水稻（Oryza sativa L.）和玉米（Zea mays L.）是世界两大主要的粮食作物,在全球范围内都有着广泛的种植,每年由病害所导致的产量和经济损失也是极其严重的。稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）和禾谷炭疽菌（Colletotrichum graminicola）分别是水稻和玉米两种作物的代表性病原真菌。近年来的研究表明,由于两种真菌同属半活体营养型,因此在发病条件和侵染机制上存在着一些相似性,但在某些生物学特性、具体的侵染方式和致病发育过程中也存在明显不同。到目前为止,关于稻瘟病菌的致病机制研究已取得了较大进展,而对禾谷炭疽菌的研究还相对滞后。生物体细胞内的磷酸化与去磷酸化过程与细胞的发育、分化及信号转导等多种生命进程都有着密切的关系。在真核生物细胞中该过程处于一个动态的平衡状态,是蛋白激酶（protein kinases,PKs）与蛋白磷酸酶（protein phosphatases,PPs）共同作用的结果。已有研究表明,蛋白激酶在病原真菌的生长发育、产孢、致病等过程中起着重要的作用,但是磷酸酶在以上过程中的作用仍然不是十分清楚。本实验室在前期有关稻瘟病菌研究基础上,针对与人类PTEN基因同源的蛋白质酪氨酸磷酸酶基因在稻瘟菌与禾谷炭疽菌中的功能进行研究,以期解析蛋白质酪氨酸磷酸酶调控稻瘟菌和禾谷炭疽菌生理和侵染过程中的作用。我们从稻瘟菌插入突变体库中利用H2O2为筛选媒介得到了一株对H2O2敏感且致病能力减弱的菌株S28515,经分析突变位点所在的基因编码一种假定的蛋白质磷酸酶Mo PTEN。生物信息学分析显示该磷酸酶属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族,具有该家族保守的结构域和催化活性位点。酶活测定显示该蛋白同时具有蛋白磷酸酶和脂类磷酸酶活性。该基因在附着胞形成和致病阶段有着较高的表达量,测序结果显示其在不同时期存在着选择性剪接的现象。亚细胞定位结果显示Mo PTEN在营养生长菌丝中表达不明显,但侵染开始后在附着胞和侵染菌丝中表达量增大。Mo PTEN基因的敲除并不影响突变体的营养生长和孢子形态,但分生孢子产量下降、萌发早期延迟且附着胞的生成量下降。与野生型菌株相比ΔMo PTEN对高浓度的H2O2更为敏感,侵染过程中不能及时清除宿主产生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）,预示着Mo PTEN可能参与了稻瘟菌侵染宿主时对抗植物免疫反应的过程。在完整水稻叶片的致病性测定中发现突变体的致病能力较野生型减弱。在划伤叶片的点接实验中互补菌株ΔMo PTEN/Mo PTEN-1的致病能力未恢复,但互补菌株ΔMo PTEN/Mo PTEN-2的致病性较突变体增强,从而表明Mo PTEN-2剪接形式与稻瘟菌的致病能力相关。显微观察显示大多数互补菌株ΔMo PTEN/Mo PTEN-1虽然能够在水稻叶鞘细胞表面形成附着胞,但之后很难进一步形成正常的侵染菌丝,而互补菌株ΔMo PTEN/Mo PTEN-2虽然形成的成熟附着胞较少,但其他正常发育的分生孢子形成的侵染菌丝却要多于ΔMo PTEN/Mo PTEN-1。由此推测两种剪接形式可能在稻瘟菌侵染水稻的过程中以接力的形式发挥了作用。此外在Mo PTEN缺失的情况下,突变体的疏水性减弱,所形成的附着胞细胞壁不完整,产黑色素能力下降,且突变体的有性生殖能力减弱。将稻瘟菌中Mo PTEN的氨基酸序列在禾谷炭疽菌中进行比对,发现了与其同源性较高的蛋白质,经分析该蛋白为一种推测的蛋白质酪氨酸磷酸酶,将其命名为Cg PTPM1。生物信息学分析表明与Mo PTEN相似,Cg PTPM1同样具有蛋白质酪氨酸磷酸酶家族保守的结构域和催化位点,经检测Cg PTPM1具有磷酸酶活性。测序与基因表达量分析显示Cg PTPM1在禾谷炭疽菌的生活史中不存在选择性剪接,但是与Mo PTEN类似其在生成附着胞和致病过程中也有着较高的表达量。生物学研究显示,Cg PTPM1的缺失并没有影响禾谷炭疽菌的营养生长和孢子形态,但是突变体的产孢量明显下降。孢子萌发率下降,萌发时间较野生型有所延迟,突变体的附着胞的生成量减少。液体摇培结果显示,与野生型相比突变体的黑色素形成延迟,且由孢子所形成的菌丝球形态较蓬松。致病实验中,突变体的致病能力下降,显微观察显示分生孢子在侵染过程中所形成的附着胞减少,初级侵染菌丝形成量较少且发育延迟,不能有效形成次级侵染菌丝。Cg PTPM1的缺失使突变体对H2O2更为敏感。突变体的疏水性减弱,受刚果红和SDS的抑制更为明显,表明突变体的细胞壁完整性受到破坏。亚细胞定位显示Cg PTPM1存在于禾谷炭疽菌的线粒体中。综上,本论文在稻瘟菌和禾谷炭疽菌中对推测的蛋白质酪氨酸磷酸酶基因Mo PTEN和Cg PTPM1进行了比较研究。结果显示磷酸酶基因Mo PTEN和Cg PTPM1分别与稻瘟菌以及禾谷炭疽菌的分生孢子产生、附着胞形成和致病能力等生理过程相关,参与了菌体的疏水性以及细胞壁的完整性维持。同时也在一定程度上参与了两种病原真菌应对由ROS所引起的宿主的防卫反应过程。该研究结果一定程度上反映了蛋白质酪氨酸磷酸酶在半活体营养型病原真菌中的作用,也为靶向酪氨酸磷酸酶基因调控途径的药物设计提了一定的理论参考,因此具有重要的经济价值和科学意义。
杨昱丹[3]（2021）在《红色红曲菌M7中LaeA和Gcn5相互作用关系研究》文中认为本实验室之前对红曲菌的研究发现全局调控因子Lae A会对组蛋白乙酰化的水平造成影响。与野生型菌株M7相比,△Mrlae A的组蛋白乙酰化水平明显下降,而过表达菌株trp C（p）::lae A的组蛋白乙酰化水平明显上升。这提示Lae A可能通过调节组蛋白乙酰化来调节各项生命活动。基于此,本研究进一步分析了M7、△Mrlae A、△Mrgcn5、trp C（p）::lae A、△Mrlae A::trp C（P）::Mrgcn5和△Mrgcn5::trp C（P）::Mrlae A菌株在环境胁迫和转录组方面的异同点,为探究Lae A与Gcn5对代谢发育的调控机制和相互作用关系奠定基础,具体研究结果如下:1、构建过表达菌株△Mrlae A::trp C（P）::Mrgcn5和△Mrgcn5::trp C（P）::Mrlae A。本研究首先构建了Mrgcn5和Mrlae A的过表达载体p CMrgcn5和p CMrlae A,然后采用农杆菌介导的转化方法,将过表达载体转入△Mrlae A和△Mrgcn5菌株中,分别获得325和272株转化子,然后通过PCR筛选得到NO.65（△Mrlae A::trp C（P）::Mrgcn5）菌株和NO.31（△Mrgcn5::trp C（P）::Mrlae A）菌株。鉴定结果表明,NO.65菌株中的Mr Gcn5过表达盒以同源重组的形式定点整合到出发菌株△Mrlae A的基因组中,而NO.31菌株中Mrlae A过表达盒以非同源重组的方式整合到出发菌株的基因组中。2、△Mrlae A::trp C（P）::Mrgcn5和△Mrgcn5::trp C（P）::Mrlae A菌株的表型分析。以亲本菌株△Mrlae A和△Mrgcn5为对照,分析△Mrlae A::trp C（P）::Mrgcn5和△Mrgcn5::trp C（P）::Mrlae A在高渗透压、高氧化活性和细胞壁抑制剂的培养基条件下的菌株生长情况。结果表明,Mrgcn5过表达会轻微影响△Mrlae A的氧化调控和渗透压调控过程。而在△Mrgcn5菌株中过表达Mrlae A并未对环境胁迫耐受力产生显着影响。3、转录组水平分析,探究Mrlae A和Mrgcn5调控基因表达变化情况。通过RNA-seq得到转录组数据,筛选差异表达基因,并对其进行GO与KEGG pathway富集分析,发现Mrlae A对有性发育和次级代谢具有直接调控作用,Mrgcn5对核迁移及初级代谢进行调控并进而影响其次生代谢水平。△Mrlae A::trp C（P）::Mrgcn5菌株（lg65）相对△Mrlae A在信号转导和转运活性上发生转录上调,对细胞周期和减数分裂则有负面影响。
刘常利[4]（2021）在《柑橘黑点病生防菌筛选、鉴定和制剂开发》文中研究指明柑橘黑点病,也称砂皮病,是一种重要的柑橘真菌性病害,严重影响柑橘的品质,给果农造成重大经济损失。黑点病的致病菌为柑橘间座壳菌（Diaporthe citri）,以田间枯枝病残体上产生的分生孢子为主要侵染源;果园生产过程中产生的大量枯枝既是可成为黑点病致病菌的繁殖基质材料,也是难以处置的重要、物污染废物。寻找既可以杀灭枯枝中滋生的黑点病病原真菌又可以加快枯枝降解的生防菌,在此基础上研发出制剂和田间处理技术,这对于生产实践具有重要的科学意义和实际应用价值。本文筛选到同时具有拮抗柑橘黑点病菌和加快枯枝降解的生防真菌3株,将其制备成可湿性粉剂制剂,并进行了室内和大田生防效果验证;构建了测定D.citri的实时荧光定量PCR技术体系,对利用生防菌处理枯枝过程中黑点病菌的数量进行动态监测。具体研究结果如下:1.获得3株既具抑制黑点致病菌又具降解枯枝能力的生防菌。通过与致病菌的对峙培养试验、枯枝降解试验在柑橘园枯枝中分离筛选到兼具D.citri抑制作用和枯枝降解作用的生防真菌三株。通过形态学和分子生物学方法将3株菌株鉴定为2个种,其中一株为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）,菌株编号WLP31;另外两株为Trichoderma asperelloides种,菌株编号WLA94、WL123。对三株生防真菌对黑点病菌的抑制效果、枯枝降解效果、作物安全性、菌株生长速度、产孢速度和漆酶产酶量等指标进行了量化。2.分别制备出三株生防木霉菌株的可湿性粉剂。制剂的配方如下:有效成分为分生孢子,含量5%;载体为硅藻土,含量87%;润湿剂选择十二烷基苯磺酸钠,含量3%;分散剂为木质素磺酸钠,含量5%,紫外保护剂为荧光素钠,含量为5 mg/kg。产品最终质量参数如下:孢子含量5.8*108个/g,润湿时间17 s,悬浮率92%,水分含量2.7%,p H值7.6,25℃储藏120 d后孢子萌发率为93.25%3.构建出针对D.citri的快速定量检测体系。在D.citri的翻译延长因子（TEF1-α）序列中筛选到特异性引物一对,具体信息如下:正向引物WL-F:5’-CACTGCACCTCAAATCATCAGCCT-3’,反向引物WL-R:5’-GGTGGTGACAAGGAT-3’;优化了从枯枝中提取黑点病菌DNA的方法和QPCR检测条件,其检测灵敏度:0.013 pg/μL,比PCR条件下监测灵敏度高出1000倍。4.对三种生防菌制剂进行了室内和大田效果验证,发现三种生防制剂均可满足枯枝降解和病原菌杀灭要求。效果评价结论如下:1)室内枯枝降解实验:三种生防制剂均可以高效降解枯枝,处理30 d、90 d和120 d后,相对于空白对照,田间枯枝粉碎物的干物质分别降低10%、25%和25%-35%;2)室内病原菌抑制实验:三种生防制剂分别对田间枯枝粉碎物处理7d,均可将每克枯枝中初始含有的超3*104拷贝数的致病菌处理至低于QPCR体系检出阈值;3)大田枯枝降解实验:发酵培养60 d,WLA94、WL123、WLP31三种生防制剂的加入使田间枯枝粉碎物干物质重量降低的比例相对于空白对照分别增加了14.89%,13.48%和10.83%;4)大田柑橘果面黑点病防治试验证明三种生防菌制剂的喷施对于黑点病在果面的发生具有预防作用,且相对防效和生防菌使用浓度呈正相关。
胡懋[5]（2021）在《根癌农杆菌介导黑曲霉外源基因表达系统的建立及优化》文中进行了进一步梳理黑曲霉（Aspergillus niger）作为一类重要的发酵工业菌种,内含多种性能优良的酶系,可用于生产糖化酶、纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶等数十种酶制剂。此外,由于黑曲霉拥有大肠杆菌表达系统所不具备的优越性,是真核活性蛋白的优良载体。因此,黑曲霉在饲料工业、食品工业、医药等领域有极大的应用价值。但是,传统遗传转化方法对黑曲霉的转化效率和遗传稳定性不高,极大限制了丝状真菌表达系统的开发。本研究借助根癌农杆菌介导转化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）建立了黑曲霉的遗传转化体系。以黑曲霉CICC2629为宿主菌,优化转化条件提升了转化效率,成功赋予宿主菌潮霉素抗性。此外,以增强型绿色荧光蛋白基因（Enhanced green fluorescent protein gene,e GFP）为标记基因,在黑曲霉中研究了不同启动子对目的基因表达水平的影响,进而筛选出最适用于本宿主菌表达外源基因的启动子。我们利用葡聚糖酶基因在黑曲霉中进行验证,并进行酶学性质测定。初步探究了真核序列Kozak sequence（GCCACC）对黑曲霉蛋白翻译水平的影响。最后,对黑曲霉发酵条件进行了优化。研究结果如下:1.通过对8株黑曲霉的生长特性及其潮霉素敏感度分析,最终选定CICC2629做为本研究宿主菌,并用ATMT技术成功将潮霉素磷酸转移酶基因（Hygromycin B phosphotransferase gene,hph）整合到宿主菌基因组中。优化后ATMT转化条件为:选用农杆菌AGL-1,AS浓度为200μmol/L,黑曲霉孢子浓度5.0×106个/m L-1.0×107个/m L,以玻璃纸为共培养基质,22℃避光正置共培养48 h后转膜,最高可以获得75±5个转化子,最高阳性率达到93.9%,平均保持在89.92%以上,较优化前转化效率提升了2.03倍,连续传代5次仍然能检测到hph基因,遗传稳定性良好。2.选择三个启动子gpd A、gla A和Tox A分别驱动e GFP基因在黑曲霉中的表达。通过对荧光强度和像素值分析,检测出三种启动子启动外源基因表达能力为:gpd A>gla A>Tox A。同时通过q PCR检测e GFP基因的相对表达量,启动子gpd A启动基因表达能力分别是gla A和Tox A的3.26倍和4.82倍。3.以启动子gpd A和gla A介导了葡聚糖酶基因（An-pi Glu）基因在黑曲霉中的表达,最终测定该酶的酶活为74.43 U/m L,最适温度为60℃,最适p H值为6.5,在37℃和50℃耐受60 min分别能保持63.1%和49.4%以上的相对酶活,60℃和65℃的半衰期分别为15 min和7 min;在p H值3.0–11.0的缓冲液中处理60 min仍能保持66.1%以上的相对酶活。β-巯基乙醇、DTT、丙三醇对此酶的激活作用最强,依次是未处理的1.94倍、1.91倍和1.79倍,Li+、Tween80、Triton X100、乙酸、乙醇、甲醇、PEG4000、乙酸乙酯、尿素同样对此酶有激活作用。Ag+和Hg2+对此酶有强烈抑制作用。An-pi Glu基因表达量结果:gla A+Kozak-An-pi Glu基因表达量较未添加Kozak序列组上调了1.71倍,gpd A+Kozak组上调了1.50倍,表明Kozak序列能增强黑曲霉基因表达水平。4.优化了黑曲霉发酵条件,蛋白表达水平较初始发酵提升了5.05倍。优化发酵条件:发酵温度为30℃,时间为168 h,按3%接种浓度为1.0×107/m L的新鲜孢子悬浮液。最佳发酵培养基基于原始配方,碳源可选择微晶纤维素、维生素C、木聚糖,选择黄豆饼粉作为氮源,蛋白表达水平均明显提高。综上所述,以上研究结果有助于建立稳定高效的丝状真菌表达体系,为丝状真菌遗传转化、蛋白表达、发酵工艺方面的研究提供参考。
谢夏[6]（2020）在《里氏木霉sec6基因对菌丝分支和产酶的影响》文中研究表明里氏木霉因其纤维素酶产量高、产酶活力高而被广泛应用于工业生产纤维素酶,但其纤维素酶产量仍有待提高,如何进一步提高其纤维素酶产量成为目前研究的热点。大量研究表明,丝状真菌通过菌丝尖端向细胞外分泌蛋白质,据此推测:菌丝分支的增加可以产生更多的菌丝尖端,因而可以达到提高蛋白产量的目的。目前已报道影响真菌菌丝分支的基因有很多,比如ras1,ras2,rho A,spa2,cla4,cdc42和rac A等等,这些基因大都参与细胞极性的建立、胞内物质的运输等过程,对这些基因进行编辑之后观察到的结果是菌丝分支都会产生明显的变化。酿酒酵母Sec6参与细胞的胞吐作用,在细胞壁的构建和细胞极性建立等方面也起着重要作用;白色念珠菌Sec6参与细胞内物质的运输和递送,sec6基因的缺失会导致白色念珠菌菌丝分支的减少。本研究通过数据库搜索查找到里氏木霉与白色念珠菌sec6同源的基因,拟对里氏木霉sec6基因进行过表达和敲除来证实该基因对里氏木霉菌丝分支以及产酶能力的影响。本研究主要得到以下结果:（1）钙离子在一定程度上对里氏木霉的菌丝分支具有促进左右,但是不同的菌株受钙离子影响的程度不同,在4个候选里氏木霉菌株中,340554菌株受钙离子影响最大,在有钙离子和无钙离子的培养条件下,菌丝分支差异最显着,说明此菌株在不同条件下菌丝分支差异比较大,是良好的研究菌丝分支的材料,因此选择该菌株来研究里氏木霉菌丝分支相关基因。（2）在NCBI数据库中查找里氏木霉中与白色念珠菌sec6同源的基因,然后设计引物对里氏木霉340554菌株中该基因进行扩增并测序,扩增序列测序结果与NCBI数据库公布序列一致。然后对在有钙离子培养条件下sec6基因的转录水平进行测定,结果是在有钙离子条件下sec6基因的转录水平高于不含钙离子培养条件下的转录水平。（3）成功构建sec6过表达质粒,并将该质粒成功转化入里氏木霉340554菌株中,得到sec6过表达转化菌株。通过对过表达转化菌株和出发菌株各项生理生化特征对比发现:sec6过表达转化菌株菌丝生长速率较慢,测量固体培养48 h的菌落直径,和出发菌株相比,过表达转化菌株的生长速率降低了31.29%。通过对发酵5 d的酶液胞外蛋白总量进行测定,发现与出发菌株相比,胞外蛋白总量提高了14.8%。通过对sec6基因进行荧光定量检测,发现过表达转化菌株的sec6基因转录水平比出发菌株提高了31.87%。（4）通过转化得到了能够稳定遗传并表达Cas9的里氏木霉菌株,选育出的Cas9转化菌株的形态和纤维素酶活性与出发菌株相比没有明显差异,可以确保Cas9编码基因的导入和表达不会干扰其他基因的表达和功能,为里氏木霉基因功能研究提供了良好的材料;并成功构建靶向sec6基因的g RNA和d DNA质粒,可以用于sec6基因的敲除。从过表达结果来看,sec6基因确实对里氏木霉的菌丝分支和产纤维素酶能力有很大的影响,这个结果验证了本研究初期的猜想。
杨永青[7]（2020）在《油菜黑胫病菌Leptosphaeria maculans对甾醇脱甲基酶抑制剂（DMI）的抗药性及分子机理研究》文中研究表明黑胫病（Blackleg）是世界范围的油菜（Brassica napus）真菌病害,其病原菌为Leptosphaeria属的复合种,影响着油菜籽的产量和品质。该病害在澳大利亚、加拿大、欧洲、中国等油菜产区均有发生,制约着油菜产业的发展和国际贸易。目前,防治措施主要包括选育和栽培抗病油菜品种、科学的农艺管理,以及使用化学杀菌剂。甾醇脱甲基酶抑制剂（Sterol demethylation inhibitor,DMI）是一类广泛使用的杀菌剂,通过抑制靶标蛋白14?-脱甲基酶的生物活性,进而抑制病原菌细胞膜的合成,该靶标蛋白的编码基因为ERG11（亦称CYP51）。DMI单一作用位点的杀菌方式易造成病原真菌出现抗药性,已在众多植物病原菌中大量报道,包括2017年首次报道的黑胫病菌（Leptosphaeria maculans）,但L.maculans对DMI的抗药性分子机理有待进一步研究。本论文开展了油菜黑胫病菌L.maculans抗药性菌株的筛选和识别,并对田间抗药性菌株的抗药性水平、分子机理进行了系统研究,首次阐释了黑胫病菌L.maculans对DMI杀菌剂的抗药性分子机理,主要结果如下:（1）采用“孢子浴”侵染油菜植株法（in planta）,筛选并识别出6株具有DMI抗药性的L.maculans田间抗药性菌株,其能够侵染杀菌剂处理的油菜植株并产生显着性的叶面损伤,分别命名为18BL149-18BL154;与敏感菌株相比,抗药性菌株对4种DMI类杀菌剂的EC50值均不同程度的增加,且对其中至少一种杀菌剂的EC50值显着性高于敏感菌株;同时5株抗药性菌株的环境适应性并未显着性下降,仅菌株18BL153的产孢量较敏感菌株降低,但其致病力未受影响;（2）测序并分析抗药性菌株的ERG11基因编码区,未发现任何基因多态性变化;进一步对其启动子区（编码区上游1000 bp区域）研究发现,在抗药性菌株18BL149、18BL150、18BL153的ERG11启动子区分别存在5267 bp、5248 bp、5263 bp的基因片段插入,且插入位点不同;而在抗药性菌株18BL151、18BL152的ERG11启动子区的相同位置（-102 bp）存在275 bp的基因片段插入;插入片段的GenBank登录号为MN331773-MN331776;在菌株18BL154的ERG11启动子中未发现任何序列改变;（3）对插入序列进一步比对分析得出,长度约为5000 bp的三种插入序列均属于I型转座子（retrotransposon）Zolly-2家族,尽管这三种转座子插入的位置和长度不同,但是其两侧的长末端重复序列相似度高,且序列中包含DNA重复序列突变（Repeat-induced point mutation,RIP）,遵循C-T和G-A的碱基替换规律;菌株18BL151和18BL152中的插入片段的序列完全相同,且在L.maculans的基因组上存在多个拷贝（>400）,属于转座子Pholy家族;（4）对靶标基因的表达量分析得出,启动子中的275 bp、5263 bp转座子插入显着性增加了抗药性菌株中ERG11基因的诱导表达量（induced expression）,且可在杂交子代中稳定遗传,分离比例符合单一基因控制的遗传分离,证明启动子中的转座子插入导致了L.maculans抗药性的产生;另外,田间抗药性菌株中ERG11的相对表达量与其对戊唑醇的敏感性(EC50)之间呈显着正相关;（5）克隆抗药性菌株的ERG11启动子、编码区及终止子区,并将其在敏感菌株中表达,使敏感菌株获得了DMI抗药性,且抗药性转化株的ERG11诱导表达量与其敏感性(EC50)之间呈显着正相关;（6）通过PCR法将突变碱基引入靶标基因ERG11中,并将含碱基突变组合（I381V、Y459/G460缺失、W461G）的靶标基因ERG11在敏感菌株中表达,结果发现含有突变点的靶标基因显着增加了敏感菌株的抗药性,其抗性因子达15.82,且含突变点的抗药性转化株的环境适合度和致病力均未下降。综上研究结果可得出结论:油菜黑胫病菌L.maculans对DMI类杀菌剂产生抗药性的分子机理为,靶标基因ERG11启动子区的转座子插入,上调ERG11的表达量,或者ERG11编码区存在I381V、Y459/G460缺失、W461G的碱基突变组合,均会导致L.maculans对DMI类杀菌剂产生抗药性。
陈鑫源[8]（2019）在《木材腐朽菌的DNA提取及PCR检测研究》文中指出木材腐朽就是木材本身的细胞壁在真菌的作用下逐渐发生分解,进而导致其出现糟烂或者解体,主要是由能够对木材进行入侵腐蚀的真菌的生长代谢而造成。木材的节约利用是当今社会有效发展循环经济、塑造成节约型社会的重要要求,想要从根本上解决问题则需找到腐蚀原因。木材腐朽在多数的情况下是由对木材本身具有腐蚀能力的相关真菌的生长繁殖所造成的,这种真菌主要可以分为三类:霉菌、变色菌、木材腐朽菌。木材腐朽菌种类繁多,可分为白腐菌、褐腐菌和软腐菌三类。其中,木材白腐菌在木材腐朽菌中的比例最大,而且能够降解木材中的大部分成分,是目前明确报道的菌株中能够在纯培养过程中彻底降解木质素的唯一类微生物,所以这类菌株对多种毒害、不易降解的化合物具有非常强的降解能力,因此具有非常显着的生物降解能力。白腐菌的生理代谢过程比较复杂,在适宜条件下菌丝的生长过程中菌丝体的生长较为旺盛并为多核,因真菌的基因组提取受到多种条件的限制,因此对总基因组DNA的提取方法进行研究是对该菌类生物学机制的研究基础,而且也能为后期的改造与研究提供帮助,同时获得DNA的质量也会影响接下来的PCR扩增。利用PCR技术对菌株进行鉴定具有简单、快速、高效、准确、无污染等多个优点,因此深受广大专家学者的喜爱。本文首先对从腐朽的木材上分离获得木材腐朽菌,对其进行培养并进行形态学的初步鉴定,再通过分子生物学领域PCR法对其进行有效性鉴定,对其进行综合的比对分析,从而获得较为准确的菌种相关信息。经过研究获得以下结果:（1）通过对木材腐朽真菌的子实体进行采集和组织块的切取,对其进行消毒,划线,分离及纯化获得较为纯的真菌,并对其进行最基本的形态学分析,生长较快,呈现毛绒状等特点。（2）通过分别采用蜗牛酶法、CTAB法、SDS法和蛋白酶K对木材腐朽真菌的全基因进行提取,且对提取的DNA进行紫外吸收光谱和琼脂糖凝胶电泳（AGE）检测,进行不同种提取方法结果的比较,经实验发现,蜗牛酶法、CTAB法、SDS法提取DNA纯度较蛋白酶K法较低。最终获得一种最有效的白腐真菌总DNA的提取方法为蛋白酶K法提取DNA的纯度为1.96。（3）利用设计通用性和特异性引物进行PCR产物的扩增,对扩增的产物进行纯化回收,DNA测序,进行相关序列的比对,进行分析,再进行形态生物学的观察和分析,从宏观和微观两个层面具体分析,获得结论为:木材腐朽真菌1为香栓菌,木材腐朽菌2为毛栓菌。
张贝[9]（2018）在《橡胶树胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及致病相关基因的筛选》文中提出胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是橡胶树炭疽病的主要病原真菌。为了寻找新的防控策略,有效防治橡胶树炭疽病,探究橡胶树胶孢炭疽菌的致病机理具有重要意义。病原菌T-DNA插入突变体的构建是筛选病原菌致病因子的有效手段。本研究优化了根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌真菌转化体系,构建了胶孢炭疽菌的T-DNA插入突变体库,并对突变库进行了致病性筛选,具体结果如下:1.由于胶孢炭疽菌对潮霉素不敏感而对氯嘧磺隆较为敏感,我们以pCAMBIA1300载体为骨架,用氯嘧磺隆抗性基因（SUR）替代了其中的潮霉素抗性基因（Hyg）,构建了以氯嘧磺隆为抗性筛选标记的双元载体pCAMBIA1300-SUR。2.为了获得充足的胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体转化子,我们从农杆菌菌株的选用、乙酰丁香酮（AS）预培养和共培养的浓度、胶孢炭疽菌孢子浓度以及共转化时间等几个方面对根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系进行优化。结果表明,在乙酰丁香酮（AS）浓度为100 umol/L时,使用OD600=0.8的AGL-1农杆菌菌株与浓度为106个/mL的胶孢炭疽菌孢子进行共转化48 h,转化效率最高,可使转化效率达到480个转化子/106个孢子。3.基于以上体系,我们构建了一个库容量为861的橡胶树胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库。随机挑选部分转化子进行PCR验证,结果均为阳性。表型检测结果发现,有2个突变体菌株（T003和T062）生长速度明显慢于野生型菌株,1个突变体菌株（T261）的菌落菌丝体明显比野生型的稀疏,8个突变体菌株对橡胶树叶片的致病力明显减弱,其中2个菌株（T734和T735）达极显着水平。4.通过hiTAIL-PCR技术,扩增出T734和T735突变体菌株的T-DNA插入位点侧翼序列。通过与胶孢炭疽菌野生型菌株基因组进行序列比对,确定了 T-DNA在基因组上的位置:突变体T734的T-DNA插入位点在scaffold7的514205处;T735的 T-DNA 插入在 scaffold242 的 21791 处。5.进一步对插入位点处序列在GenBank上进行同源搜索,发现突变体T735的T-DNA插入位点在一个编码FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合域蛋白（FAD binding domain）基因（XM007286226）的上游 175bp 处。该基因全长 1336bp,本研究中命名为CgFADBP。半定量RT-PCR显示T-DNA的插入导致T735突变株CgFADBP基因表达上调。6.分别构建过表达CgFADBP基因的胶孢炭疽菌突变株和胶孢炭疽菌的CgFADBP基因敲除突变株用于进一步的功能验证分析。目前已经完成CgFADBP基因敲除突变株的构建。
刘丹,李焕宇,付婷婷,张云,吕天佑,李远,李敏权,徐秉良[10]（2017）在《基于正交试验设计优化真菌DNA提取的CTAB法》文中研究指明【目的】从统计学的角度明确CTAB法提取真菌DNA过程中各因素的影响,确定CTAB法提取真菌DNA的最优方案.【方法】本试验以菌体量、破壁、抽提、沉淀为考察因素,以核糖体RNA（rRNA）内转录间隔区（ITS）和28SrRNA基因序列的PCR反应扩增率为指标,用SPSS软件设计混合水平正交试验L25（5×34）并进行方差分析.【结果】采用CTAB法提取真菌基因组DNA时,菌体细胞破壁和沉淀DNA这两个步骤对真菌DNA提取效果的影响最大,其次是抽提步骤,在100mg范围内,菌体量对DNA的提取效果影响不大.【结论】采用CTAB法提取DNA时,挑取4080mg菌体,用带有无菌塑料钻头的手电钻研磨进行菌体细胞的破壁,研磨时可先加入液氮冷冻后再进行研磨,或直接在冰上研磨,酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提1次,等体积异丙醇沉淀DNA,可以得到较好的DNA提取效果.
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 引物 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.1.4 试剂及试剂盒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 影响三孢布拉霉基因组提取效果关键因素的筛选 |
| 1.2.2 Na OH浓度、煮沸时间及基因组源对基因组提取效果的影响 |
| 1.2.3 提取的基因组稳定性测定 |
| 1.2.4 Na OH处理对后续测序、酶切等实验的影响 |
| 1.2.5 基因组快速提取法普适性分析 |
| 1.2.6 数理统计 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 影响三孢布拉霉基因组提取的关键因素 |
| 2.2 基因组提取所需的最适Na OH浓度、煮沸时间及基因组源的确定 |
| 2.3 提取的基因组稳定性分析 |
| 2.4 Na OH处理对基因组完整性的影响 |
| 2.5 方法普适性分析 |
| 2.5.1 对同一菌株不同基因的普适性 |
| 2.5.2 对不同菌株的普适性 |
| 2.6 三孢布拉霉基因组快速提取法与传统方法的比较 |
| 3 结语 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 1.1 半活体营养型真菌概述 |
| 1.1.1 植物病原真菌不同营养类型分类 |
| 1.1.2 半活体营养真菌广泛的营养利用机制 |
| 1.1.3 半活体营养型病原真菌的致病机制 |
| 1.2 稻瘟菌研究概述 |
| 1.2.1 稻瘟病及稻瘟菌简介 |
| 1.2.2 稻瘟菌的侵染循环 |
| 1.2.3 稻瘟菌的侵染机制和相关功能基因 |
| 1.3 禾谷炭疽菌研究概述 |
| 1.3.1 玉米炭疽病及其病原菌禾谷炭疽菌 |
| 1.3.2 玉米炭疽病的发病条件和侵染循环 |
| 1.3.3 禾谷炭疽菌的侵染机制和侵染过程中涉及的信号转导 |
| 1.3.4 禾谷炭疽菌与稻瘟菌在侵染机制上的比较 |
| 1.4 磷酸酶研究进展 |
| 1.4.1 蛋白质磷酸化过程概述 |
| 1.4.2 磷酸酶的分类 |
| 1.4.3 磷酸酶在植物病原真菌中的研究进展 |
| 1.5 真核生物中的选择性剪接 |
| 1.5.1 选择性剪接概述 |
| 1.5.2 剪接因子和剪接类型 |
| 1.5.3 选择性剪接在真核生物中的研究现状 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二部分 稻瘟菌蛋白质酪氨酸磷酸酶基因MoPTEN的生物功能研究 |
| 引言 |
| 第1章 稻瘟菌MoPTEN基因的表达模式、生物信息学分析和所编码蛋白质的活性研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 供试菌株 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 载体与引物 |
| 1.1.5 培养基 |
| 1.1.6 实验储备液及其制备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 菌株的培养 |
| 1.2.2 核酸的提取 |
| 1.2.3 基础分子生物学研究方法 |
| 1.2.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备方法与转化体系 |
| 1.2.5 实验所研究目的基因(MoPTEN)的确立 |
| 1.2.6 MoPTEN基因在稻瘟菌不同时期的表达模式 |
| 1.2.7 MoPTEN基因的生物信息学分析 |
| 1.2.8 MoPTEN的原核表达、纯化和活性测定 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 插入突变体S28515对H_2O_2敏感并且致病能力下降 |
| 1.3.2 T-DNA插入到MoPTEN基因的启动子区域上游部分 |
| 1.3.3 MoPTEN基因的生物信息学分析 |
| 1.3.4 通过亚细胞定位观察MoPTEN在稻瘟菌生长和致病过程中的表达情况 |
| 1.3.5 MoPTEN基因在稻瘟菌不同的时期存在可变剪接 |
| 1.3.6 MoPTEN结构域分析和三维结构预测 |
| 1.3.7 稻瘟菌MoPTEN蛋白同时具有脂类磷酸酶和蛋白磷酸酶活性 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 稻瘟菌MoPTEN基因的敲除菌株、互补菌株和亚细胞定位菌株的获得 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 载体与引物 |
| 2.1.5 所用培养基 |
| 2.1.6 实验中所用相关储备液及其制备 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 菌株的培养 |
| 2.2.2 稻瘟菌孢子的单孢分离纯化 |
| 2.2.3 核酸的提取 |
| 2.2.4 基础分子生物学研究方法 |
| 2.2.5 大肠杆菌DH5α感受态的制备方法与转化体系 |
| 2.2.6 根癌农杆菌AGL-1感受态的制作方法和AGL-1所参与的转化体系 |
| 2.2.7 MoPTEN基因敲除载体、互补载体和亚细胞定位载体的构建 |
| 2.2.8 根癌农杆菌所介导的稻瘟菌遗传转化 |
| 2.2.9 稻瘟菌转化子的检测方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 MoPTEN基因敲除载体的构建与结果验证 |
| 2.3.2 MoPTEN基因敲除菌株的获得 |
| 2.3.3 MoPTEN基因互补载体的构建结果 |
| 2.3.4 MoPTEN基因互补菌株的获得 |
| 2.3.5 MoPTEN亚细胞定位载体的构建与结果验证 |
| 2.3.6 MoPTEN亚细胞定位菌株的获得 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 MoPTEN基因在稻瘟菌生长发育和致病过程中的生物功能研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试菌株 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 所用引物 |
| 3.1.5 所用培养基 |
| 3.1.6 实验中所用相关储备液及其制备方法 |
| 3.1.7 实验中数据的统计与分析 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 不同菌株生长发育情况及菌落形态观察 |
| 3.2.2 不同菌株产孢后分生孢子的形态观察 |
| 3.2.3 不同菌株的产孢量统计和分生孢子形成过程观察 |
| 3.2.4 菌株孢子的萌发、附着胞形成情况观察 |
| 3.2.5 不同菌株对水稻叶片的致病性分析和侵染叶鞘过程的显微观察 |
| 3.2.6 不同菌株对于和H_2O_2相关的氧化应激敏感性检测 |
| 3.2.7 疏水性实验和细胞壁完整性测定 |
| 3.2.8 菌株对渗透胁迫的敏感性分析 |
| 3.2.9 稻瘟菌附着胞完整性分析 |
| 3.2.10 附着胞黑色素形成分析及相关黑色素基因表达量测定 |
| 3.2.11 菌株有性生殖形成子囊壳观察 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 MoPTEN基因的缺失不影响稻瘟菌的营养生长和孢子形态 |
| 3.3.2 MoPTEN基因的缺失导致了稻瘟菌产孢量的下降 |
| 3.3.3 MoPTEN基因的缺失导致孢子萌发率降低并推迟了孢子的萌发 |
| 3.3.4 MoPTEN基因与稻瘟菌附着胞的形成相关 |
| 3.3.5 MoPTEN基因的缺失导致了稻瘟菌致病能力的降低 |
| 3.3.6 MoPTEN基因参与了稻瘟菌侵染后菌丝的扩展和附着胞的形成 |
| 3.3.7 MoPTEN基因在清除外源H_2O_2中存在着作用 |
| 3.3.8 MoPTEN基因的缺失导致了稻瘟菌的疏水性降低 |
| 3.3.9 MoPTEN基因的缺失造成稻瘟菌细胞壁完整性下降 |
| 3.3.10 MoPTEN基因不参与稻瘟菌应对渗透胁迫应的过程 |
| 3.3.11 MoPTEN基因的缺失导致了稻瘟菌附着胞细胞壁的完整性下降 |
| 3.3.12 MoPTEN基因的缺失导致了稻瘟菌附着胞产黑色素能力下降 |
| 3.3.13 MoPTEN基因的缺失导致稻瘟菌有性生殖中形成子囊壳数量下降 |
| 3.3.14 MoPTEN基因的作用过程中受到Mo SMN 基因的调控 |
| 3.4 小结 |
| 第三部分 禾谷炭疽菌蛋白质酪氨酸磷酸酶基因CgPTPM1的生物功能研究 |
| 引言 |
| 第1章 禾谷炭疽菌CgPTPM1基因的表达模式、生物信息学分析和所编码蛋白质的活性研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 供试菌株 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 载体与引物 |
| 1.1.5 所用培养基 |
| 1.1.6 实验中所用相关储备液及其制备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 菌株的培养 |
| 1.2.2 核酸的提取 |
| 1.2.3 基础分子生物学研究方法 |
| 1.2.4 大肠杆菌DH5α感受态的制备方法与转化体系 |
| 1.2.5 确立实验所研究目的基因 |
| 1.2.6 CgPTPM1基因的生物信息学分析 |
| 1.2.7 CgPTPM1基因在禾谷炭疽菌中的表达模式分析 |
| 1.2.8 蛋白质酪氨酸磷酸酶CgPTPM1的原核表达、纯化及活性测定 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 CgPTPM1是禾谷炭疽菌中的一种蛋白质酪氨酸磷酸酶 |
| 1.3.2 CgPTPM1定位于禾谷炭疽菌的线粒体上 |
| 1.3.3 CgPTPM1基因在禾谷炭疽菌致病时期有较高的表达量 |
| 1.3.4 禾谷炭疽菌CgPTPM1具有磷酸酶活性 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 禾谷炭疽菌CgPTPM1基因敲除菌株、互补菌株和亚细胞定位菌株的获得 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 载体与引物 |
| 2.1.5 所用培养基和配制方法 |
| 2.1.6 实验中所用相关储备液及其制备 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 菌株的培养 |
| 2.2.2 禾谷炭疽菌的单孢分离纯化 |
| 2.2.3 核酸的提取 |
| 2.2.4 基础分子生物学研究方法 |
| 2.2.5 大肠杆菌DH5α感受态的制备方法与转化体系 |
| 2.2.6 根癌农杆菌AGL-1感受态的制作方法和AGL-1所参与的转化体系 |
| 2.2.7 CgPTPM1基因的敲除载体、互补和亚细胞定位载体的构建 |
| 2.2.8 根癌农杆菌所介导的禾谷炭疽菌遗传转化 |
| 2.2.9 禾谷炭疽菌转化子的检测方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 CgPTPM1基因敲除载体的构建与结果验证 |
| 2.3.2 CgPTPM1基因敲除菌株的获得 |
| 2.3.3 CgPTPM1基因互补/亚细胞定位载体的构建与结果验证 |
| 2.3.4 CgPTPM1基因互补/亚细胞定位菌株的获得 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 CgPTPM1基因在禾谷炭疽菌生长发育和致病过程中的生物功能研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试菌株 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 所用培养基 |
| 3.1.5 引物信息 |
| 3.1.6 实验中所用相关储备液及其制备 |
| 3.1.7 实验中数据的统计与分析 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 禾谷炭疽菌野生型、突变体和互补菌株营养生长的情况与菌落形态观察 |
| 3.2.2 禾谷炭疽菌的不同菌株产孢后分生孢子形态观察 |
| 3.2.3 不同菌株的产孢量统计和培养基上分生孢子产生情况观察 |
| 3.2.4 不同菌株摇菌后菌体黑色素形成和菌丝球形态观察 |
| 3.2.5 不同菌株孢子的萌发测定和附着胞形成情况观察 |
| 3.2.6 不同菌株对玉米叶片及整株玉米植株的致病性分析 |
| 3.2.7 CgPTPM1在禾谷炭疽菌应对外源压力和对细胞壁完整性影响的测试 |
| 3.2.8 不同菌株的疏水性和细胞壁完整性研究 |
| 3.2.9 DAB染色实验和内源H_2O_2含量的测定 |
| 3.2.10 在H_2O_2诱导下不同菌株中和ROS清除相关基因的表达量分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 CgPTPM1基因不参与禾谷炭疽菌的营养生长和孢子形态的形成 |
| 3.3.2 CgPTPM1的缺失导致禾谷炭疽菌产孢量下降 |
| 3.3.3 CgPTPM1基因的缺失导致菌体黑色素形成速率下降及菌丝球大小改变 |
| 3.3.4 CgPTPM1对禾谷炭疽菌分生孢子的发育和分化具有重要作用 |
| 3.3.5 CgPTPM1缺失突变体在致病能力上存在着缺陷 |
| 3.3.6 CgPTPM1基因与过量的H_2O_2的调节有关 |
| 3.3.7 CgPTPM1不参与禾谷炭疽菌应对渗透胁迫但影响细胞壁的完整性 |
| 3.3.8 CgPTPM1基因的缺失导致了禾谷炭疽菌的疏水性降低 |
| 3.4 小结 |
| 第四部分 全文研究结论 |
| 4.1 稻瘟菌研究结论 |
| 4.2 禾谷炭疽菌研究结论 |
| 第五部分 讨论与展望 |
| 5.1 全文讨论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 红曲菌概述 |
| 1.2 营养和环境条件对红曲菌代谢及发育的影响 |
| 1.3 丝状真菌全局性调控因子LaeA |
| 1.3.1 LaeA的结构 |
| 1.3.2 LaeA的功能 |
| 1.3.2.1 LaeA与 velvet复合体 |
| 1.3.2.2 LaeA对产孢的调控 |
| 1.3.2.3 LaeA对细胞疏水性影响 |
| 1.3.2.4 LaeA对次生代谢的调控 |
| 1.3.3 LaeA的调控机制 |
| 1.4 组蛋白乙酰基转移酶Gcn5 |
| 1.4.1 Gcn5 的结构 |
| 1.4.2 Gcn5 的功能 |
| 1.4.3 Gcn5 的调控机制 |
| 1.5 全局性调控因子LaeA和组蛋白乙酰基转移酶的相互联系 |
| 1.6 研究目的意义及技术路线 |
| 第二章 △Mrlae A::trp C(P)::Mrgcn5 菌株和△Mrgcn5::trp C(P)::Mrlae A菌株构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株及质粒 |
| 2.2.2 酶及主要试剂 |
| 2.2.3 主要培养基 |
| 2.2.4 主要仪器设备 |
| 2.3 过表达菌株的构建过程 |
| 2.3.1 红曲菌基因组DNA的提取 |
| 2.3.2 过表达盒的构建策略 |
| 2.3.3 过表达盒的构建步骤和条件 |
| 2.3.4 过表达载体的构建步骤 |
| 2.3.5 过表达载体转化根癌农杆菌 |
| 2.3.6 根癌农杆菌介导的过表达盒转化红曲菌 |
| 2.4 突变株的验证 |
| 2.4.1 突变株的PCR验证 |
| 2.4.2 突变株的Southern blot验证 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 Mrgcn5及Mrlae A过表达盒的构建结果 |
| 2.5.2 构建的p Ctrp C(P)::Mrgcn5和p Ctrp C(P)::Mrlae A过表达载体鉴定 |
| 2.5.3 含过表达载体的根癌农杆菌EHA105 的鉴定 |
| 2.5.4 过表达菌株的PCR验证和Southern blot分析 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 红曲菌株的生长代谢及环境胁迫分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要培养基 |
| 3.2.4 主要仪器设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 菌落及显微形态观察 |
| 3.3.2 环境胁迫分析 |
| 3.3.2.1 氧化耐受性分析 |
| 3.3.2.2 渗透压耐受性分析 |
| 3.3.2.3 细胞壁合成抑制剂耐受性分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 菌落形态及显微形态分析 |
| 3.4.2 环境胁迫分析 |
| 3.4.2.1 氧化耐受分析 |
| 3.4.2.2 渗透压耐受性分析 |
| 3.4.2.3 细胞壁合成抑制剂耐受分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于转录组数据分析Mrlae A与 Mrgcn5 的互作关系 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 主要培养基 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 红曲菌样品准备 |
| 4.3.2 转录组测序 |
| 4.4 转录组信息分析 |
| 4.4.1 红色红曲菌M7 的基因组信息 |
| 4.4.2 测序数据的质控及基因定量分析 |
| 4.4.3 DEGs的筛选及分析 |
| 4.4.3.1 GO分析 |
| 4.4.3.2 KEGG Pathway分析 |
| 4.4.3.3 基因共表达网络分析 |
| 4.5 结果与分析 |
| 4.5.1 测序数据的质控及基因定量分析 |
| 4.5.2 M7与△MrlaeA间差异基因的筛选和分析 |
| 4.5.2.1 M7与△MrlaeA间差异基因的GO分析 |
| 4.5.2.2 M7与△laeA间差异基因的KEGG分析 |
| 4.5.2.3 M7与△MrlaeA间差异基因的代谢通路分析 |
| 4.5.3 M7与△Mrgcn5 间差异基因的筛选和分析 |
| 4.5.3.1 M7与△Mrgcn5 间差异基因的GO分析 |
| 3.5.3.2 M7与△Mrgcn5 间差异基因的KEGG分析 |
| 3.5.3.3 M7与△Mrgcn5 间差异基因的代谢通路分析 |
| 4.5.4 lg65与△MrlaeA间差异基因的筛选与分析 |
| 4.5.4.1 lg65与△MrlaeA间差异基因的GO分析 |
| 4.5.4.2 lg65与△MrlaeA间差异基因的KEGG分析 |
| 4.5.4.3 lg65与△MrlaeA间差异基因的代谢通路分析 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ CTAB法提取基因组总DNA(刘姣2016) |
| 1.1 试剂及配制 |
| 1.2 操作步骤 |
| 附录 Ⅱ 根癌农杆菌介导的红曲菌转化(李利2011) |
| 2.1 试剂及配制 |
| 2.2 操作步骤 |
| 2.2.1 红曲菌孢子的制备 |
| 2.2.2 根癌农杆菌的活化及诱导培养 |
| 2.2.3 红曲菌孢子与根癌农杆菌的共培养 |
| 2.2.4 红曲菌转化子的筛选 |
| 附录 Ⅲ 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 柑橘黑点病的发生与防治 |
| 1.1.1 柑橘黑点病研究现状 |
| 1.1.2 柑橘黑点病的检测与防治 |
| 1.2 DNA提取方法的研究历史和发展趋势 |
| 1.3 QPCR技术在植物病害检测上的应用 |
| 1.3.1 植物病害检测方法分类 |
| 1.3.2 QPCR检测在植物病害检测上的应用进展 |
| 1.4 木霉主要功能及其制剂应用 |
| 1.4.1 木霉主要功能 |
| 1.4.2 木霉的商品化制剂研究进展 |
| 1.5 本文的研究目的与内容 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 柑橘园枯枝样本(用于分离生防菌) |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 黑点病致病菌相关菌种 |
| 2.1.5 生防菌制剂所需试剂产品 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 柑橘黑点病致病菌QPCR快速检测体系的建立 |
| 2.2.2 柑橘枯枝中寄生的黑点病致病菌D.citri的DNA提取方法的确立 |
| 2.2.3 枯枝所携带真菌的分离与鉴定 |
| 2.2.4 对黑点病菌具有生防作用的真菌筛选 |
| 2.2.5 生防菌制剂成分的筛选 |
| 2.2.6 生防菌制剂的效果评价 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 QPCR快速检测体系的建立 |
| 3.2 柑橘枯枝中寄生的黑点病致病菌DNA提取方法的确立 |
| 3.3 柑橘园枯枝携带真菌的分离和鉴定 |
| 3.4 对黑点病致病菌具有生防作用的真菌筛选 |
| 3.5 生防菌制剂成分的筛选 |
| 3.6 生防菌制剂效果评价 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 黑曲霉表达系统的概述 |
| 1.2.1 黑曲霉内外源基因的表达 |
| 1.2.2 黑曲霉优化表达量的方法 |
| 1.2.2.1 启动子的选择 |
| 1.2.2.2 信号肽的选择 |
| 1.2.2.3 密码子偏好性优化 |
| 1.2.2.4 Kozak序列的应用 |
| 1.2.3 黑曲霉遗传转化方法 |
| 1.2.4 农杆菌介导转化真菌的研究 |
| 1.2.4.1 农杆菌介导转化真菌的研究进程 |
| 1.2.4.2 ATMT技术的转化机制及实验步骤 |
| 1.2.4.3 ATMT 转化效率的影响因素 |
| 1.3 绿色荧光蛋白基因 GFP 在真菌中的应用 |
| 1.4 β-葡聚糖酶的研究概况 |
| 1.4.1 微生物来源的 β-葡聚糖酶 |
| 1.4.2 动物和植物来源的 β-葡聚糖酶 |
| 1.4.3 β-葡聚糖酶的研究进展 |
| 1.4.4 β-葡聚糖酶的应用 |
| 1.4.4.1 β-葡聚糖酶在饲料工业中的应用 |
| 1.4.4.2 β-葡聚糖酶在啤酒酿造业中的应用 |
| 1.4.4.3 β-葡聚糖酶在食品工业中的应用 |
| 1.4.4.4 β-葡聚糖酶在生物防治中的应用 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 研究内容及技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 黑曲霉CICC2629遗传转化体系的建立及优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 工具酶与主要试剂 |
| 2.1.4 常用溶液 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 黑曲霉宿主菌的选择 |
| 2.2.1.1 不同黑曲霉菌株生长速度及产孢能力的监控 |
| 2.2.1.2 黑曲霉菌株对潮霉素敏感度测试 |
| 2.2.2 中间双元载体的构建 |
| 2.2.2.1 基础质粒的提取 |
| 2.2.2.2 潮霉素表达盒的制备. |
| 2.2.2.3 大肠杆菌感受态E.coli DH5α 的制备 |
| 2.2.2.4 基础双元质粒双酶切 |
| 2.2.2.5 潮霉素表达盒与线性化基础质粒pCAMBIA3301的连接转化 |
| 2.2.2.6 重组质粒转化子阳性鉴定. |
| 2.2.3 农杆菌感受态的制备 |
| 2.2.4 重组质粒转化农杆菌 |
| 2.2.4.1 农杆菌p CA-Hyg转化子阳性鉴定. |
| 2.2.5 根癌农杆菌介导黑曲霉的遗传转化 |
| 2.2.5.1 黑曲霉孢子悬浮液的制备 |
| 2.2.5.2 农杆菌避光诱导培养 |
| 2.2.5.3 黑曲霉孢子与农杆菌菌液诱导共培养 |
| 2.2.6 黑曲霉转化株鉴定 |
| 2.2.6.1 转化株基因组提取及PCR鉴定 |
| 2.2.6.2 转化株黑曲霉潮霉素稳定性检测 |
| 2.2.7 ATMT转化条件的优化 |
| 2.2.7.1 农杆菌种类的优化 |
| 2.2.7.2 共培养乙酰丁香酮浓度的优化 |
| 2.2.7.3 共培养膜基质的优化 |
| 2.2.7.4 共培养温度和时间的优化 |
| 2.2.7.5 黑曲霉孢子浓度的优化 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 黑曲霉生长速度及产孢能力分析 |
| 2.3.2 潮霉素对黑曲霉抑制情况分析 |
| 2.3.3 中间双元载体的构建结果分析 |
| 2.3.3.1 潮霉素表达盒的制备结果 |
| 2.3.3.2 基础质粒 pCAMBIA3301 线性化结果 |
| 2.3.3.3 线性化质粒 pCAMBIA3301 与 gpd-hgy 片段连接转化及转化子鉴定 |
| 2.3.4 根癌农杆菌转化子阳性鉴定分析 |
| 2.3.5 农杆菌与黑曲霉诱导共培养分析 |
| 2.3.6 转化子基因组为模板PCR阳性鉴定及测序分析 |
| 2.3.7 转化子遗传稳定性分析 |
| 2.3.8 ATMT转化法最适条件分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 讨论 |
| 2.4.2 小结 |
| 第3章 eGFP基因在黑曲霉中的表达及启动子的选择 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 工具酶与主要试剂 |
| 3.1.4 常用溶液 |
| 3.1.5 培养基 |
| 3.1.6 DNA测序与引物合成 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 三种eGFP双元表达载体的构建 |
| 3.2.1.1 eGFP 表达盒 gpdA-eGFP-trp C、glaA-eGFP-trp C、ToxA-eGFP-NOS 各组分基因的制备 |
| 3.2.1.2 中间双元质粒pCAMBIA-gpdA-hyg的双酶切 |
| 3.2.1.3 表达盒 gpdA-eGFP-trpC、gla A-eGFP-trp C、ToxA-eGFP-NOS 各片段的连接及转化 |
| 3.2.1.4 重组质粒转化子阳性鉴定 |
| 3.2.2 重组eGFP表达质粒转化农杆菌 |
| 3.2.2.1 农杆菌eGFP转化子鉴定 |
| 3.2.3 根癌农杆菌介导黑曲霉的遗传转化 |
| 3.2.4 黑曲霉转化子鉴定 |
| 3.2.4.1 荧光显微镜检查转化子 |
| 3.2.4.2 eGFP转化子剖面荧光强度分析 |
| 3.2.4.3 eGFP转化子基因组 PCR 鉴定 |
| 3.2.5 qPCR测定eGFP基因相对表达量 |
| 3.2.5.1 eGFP转化子RNA提取 |
| 3.2.5.2 RNA反转录cDNA |
| 3.2.5.3 实时荧光定量 PCR |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 eGFP表 达质粒p CAMBIA-gpd A-eGFP-trp C、p CAMBIA-gla A-eGFP-trp C和p CAMBIA-Tox A-eGFP-NOS的构建结果分析 |
| 3.3.2 重组质粒转化子阳性验证及测序分析 |
| 3.3.3 三种eGFP表达质粒转化农杆菌及转化子阳性验证 |
| 3.3.4 黑曲霉转化株鉴定 |
| 3.3.4.1 荧光显微镜检查转化子 |
| 3.3.4.2 转化子基因组模板PCR鉴定 |
| 3.3.4.3 转化子剖面荧光强度分析 |
| 3.3.5 实时荧光定量PCR测定eGFP基因相对表达量 |
| 3.3.5.1 eGFP转化子RNA提取 |
| 3.3.5.2 eGFP基因转录水平检测. |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 讨论 |
| 3.4.2 小结 |
| 第4章 葡聚糖酶在黑曲霉中的表达及酶学性质的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株与质粒 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 工具酶与主要试剂 |
| 4.1.4 所用溶液 |
| 4.1.5 培养基 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 葡聚糖酶表达载体pCA-gpdA-An-Glu 和 pCA-glaA-An-piGlu的构建 |
| 4.2.1.1 葡聚糖酶基因的制备 |
| 4.2.1.2 质粒pGH-glaA-box 和 pGH-gpdA-box 的线性化 |
| 4.2.1.3 gpdA-An-Glu和 glaA-An-Glu 基因与线性化载体的连接转化 |
| 4.2.1.4 重组质粒转化子阳性鉴定 |
| 4.2.1.5 gpdA-An-Glu-box 和 glaA-An-Glu-box 的制备 |
| 4.2.1.6 葡聚糖酶表达盒与线性化中间双元载体pCAMBIA3301-gpdA-hyg的连接及转化 |
| 4.2.1.7 葡聚糖酶双元表达质粒的阳性鉴定 |
| 4.2.2 提高表达量质粒的改造及验证 |
| 4.2.3 葡聚糖酶表达载体转化农杆菌及转化子鉴定 |
| 4.2.4 含有葡聚糖酶表达载体的根癌农杆菌介导转化黑曲霉及转化子鉴定 |
| 4.2.5 黑曲霉的发酵及SDS-PAGE凝胶电泳检测 |
| 4.2.5.1 黑曲霉的发酵 |
| 4.2.5.2 葡聚糖酶的SDS-PAGE凝胶电泳检测 |
| 4.2.6 葡聚糖酶An-Glu的酶学性质测定 |
| 4.2.6.1 DNS法原理及实验方法 |
| 4.2.6.2 1%(W/V)葡聚糖底物的准备 |
| 4.2.6.3 DNS法标准曲线的绘制 |
| 4.2.6.4 最适反应pH及pH稳定性测定 |
| 4.2.6.5 最适反应温度及温度稳定性测试 |
| 4.2.6.6 化学试剂及金属离子对葡聚糖酶An-Glu酶活力影响的测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 An-Glu表达载体p CA-gpd A-An-Glu和p CA-gla A-An-Glu的构建结果 |
| 4.3.2 An-Glu黑曲霉转化子的鉴定 |
| 4.3.3 黑曲霉表达An-Glu及SDS-PAGE凝胶电泳检测 |
| 4.3.4 Kozak序列优化后表达量情况及An-Glu基因表达水平分析 |
| 4.3.5 DNS法标准曲线的绘制及An-Glu酶学性质的分析 |
| 4.3.5.1 DNS标准曲线的绘制 |
| 4.3.5.2 葡聚糖酶An-Glu pH活性和pH稳定性的测定 |
| 4.3.5.3 葡聚糖酶 An-Glu 的热活性和热稳定性测定 |
| 4.3.5.4 金属离子与有机试剂对 An-Glu 酶活力的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 黑曲霉发酵条件的优化 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要培养基 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 氮源的优化 |
| 5.2.2 碳源的优化 |
| 5.2.3 发酵温度的优化 |
| 5.2.4 发酵时间的优化 |
| 5.2.5 孢子悬浮液接种量的优化 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 最优氮源的测定 |
| 5.3.2 最优碳源的测定 |
| 5.3.3 发酵温度的优化 |
| 5.3.4 发酵时间的优化 |
| 5.3.5 孢子悬浮液接种量的优化 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.1.1 黑曲霉遗传转化体系的建立及优化 |
| 6.1.2 eGFP基因在黑曲霉中的表达 |
| 6.1.3 葡聚糖酶在黑曲霉中的表达 |
| 6.1.4 黑曲霉发酵条件的优化 |
| 6.2 创新 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 实验中所用到的缓冲液及配方 |
| A1 不同pH的柠-磷缓冲液配方 |
| A2 不同pH的甘氨酸-Na OH缓冲液 |
| 附录B 本研究涉及到的基因核苷酸序列 |
| B1 gpdA启动子及信号肽的核苷酸序列(5?-3?) |
| B2 glaA启动子及信号肽的核苷酸序列(5?-3?) |
| B3 trpC终止子核苷酸序列(5?-3?) |
| B4 ToxA-eGFP-NOS表达盒核苷酸序列(5?-3?) |
| B5 葡聚糖酶基因An-Glu核苷酸序列(5?-3?) |
| 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 里氏木霉与纤维素酶 |
| 1.1.1 里氏木霉产纤维素酶的研究 |
| 1.1.2 里氏木霉纤维素酶系的分泌及表达调控 |
| 1.1.3 提高里氏木霉产纤维素酶的方法 |
| 1.2 真菌菌丝分支现象及影响因素 |
| 1.2.1 真菌菌丝分支现象及分支模式 |
| 1.2.2 影响真菌菌丝分支的理化因素 |
| 1.3 与菌丝分支相关的基因 |
| 1.3.1 sec6基因 |
| 1.3.2 ras1、ras2 基因 |
| 1.3.3 rho基因 |
| 1.3.4 spa基因 |
| 1.3.5 cla、rac、cdc基因 |
| 1.3.6 vac基因 |
| 1.3.7 vps13基因 |
| 1.3.8 cot1基因 |
| 1.3.9 gil1基因 |
| 1.3.10 丝状真菌基因功能的研究方法 |
| 1.3.11 丝状真菌的遗传转化方法 |
| 1.4 菌丝分支的研究意义及论文的立项依据 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 菌株与质粒 |
| 3.2 主要试剂及培养基的配置 |
| 3.2.1 主要试剂的配置 |
| 3.2.2 培养基的配置 |
| 3.3 实验仪器 |
| 3.4 本研究所用引物 |
| 3.5 里氏木霉核酸与胞内总蛋白的提取 |
| 3.5.1 里氏木霉总DNA的提取(CTAB法) |
| 3.5.2 里氏木霉总RNA的提取 |
| 3.5.3 里氏木霉胞内总蛋白的提取 |
| 3.5.4 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.6 反转录及荧光定量PCR |
| 3.6.1 反转录 |
| 3.6.2 荧光定量PCR |
| 3.7 里氏木霉sec6基因的过表达 |
| 3.7.1 sec6基因过表达载体的构建 |
| 3.7.2 sec6基因过表达载体的转化 |
| 3.7.2.1 根癌农杆菌的转化 |
| 3.7.2.2 根癌农杆菌介导里氏木霉的转化 |
| 3.8 使用CRISPR/Cas9 法敲除里氏木霉sec6 基因 |
| 3.8.1 gRNA的制备 |
| 3.8.2 供体DNA(d DNA)载体的构建 |
| 3.8.3 Cas9及g RNA、d DNA的转化 |
| 3.8.3.1 Cas9质粒的转化 |
| 3.8.3.2 g RNA、d DNA的转化 |
| 3.9 里氏木霉过表达/敲除菌株生理生化特征检测 |
| 3.9.1 菌体及菌落形态学观察 |
| 3.9.1.1 菌丝分支观察 |
| 3.9.1.2 产孢能力检测 |
| 3.9.2 个体及群体生长动力学 |
| 3.9.2.1 菌丝生长速率测定 |
| 3.9.2.2 液体培养条件下菌丝生物量的测定 |
| 3.9.3 生理学特征 |
| 3.9.3.1 纤维素双层平板分析 |
| 3.9.3.2 纤维素酶活力测定 |
| 3.9.3.3 胞外蛋白总量的测定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 钙离子对里氏木霉菌丝分支的影响 |
| 4.1.1 里氏木霉185284菌株菌丝分支情况统计 |
| 4.1.2 里氏木霉337997菌株菌丝分支情况统计 |
| 4.1.3 里氏木霉339931菌株菌丝分支情况统计 |
| 4.1.4 里氏木霉340554菌株菌丝分支情况统计 |
| 4.1.5 菌丝分支数据分析结果 |
| 4.2 sec6基因在里氏木霉340554中的检测 |
| 4.2.1 里氏木霉sec6基因的鉴定 |
| 4.2.2 sec6基因在里氏木霉340554中的转录水平检测 |
| 4.3 sec6基因在里氏木霉中的过表达 |
| 4.3.1 过表达质粒p DHt/sk-P-sec6 的构建 |
| 4.3.2 根癌农杆菌转化条件的优化 |
| 4.3.3 过表达转化子的验证 |
| 4.3.3.1 过表达转化子的PCR验证 |
| 4.3.3.2 过表达转化子中sec6基因的转录水平检测 |
| 4.3.4 里氏木霉sec6过表达转化菌株与出发菌株生理生化特征对比 |
| 4.3.4.1 sec6基因过表达对里氏木霉340554菌株菌丝分支的影响 |
| 4.3.4.2 sec6基因过表达对里氏木霉340554菌株生物量的影响 |
| 4.3.4.3 sec6基因过表达对里氏木霉340554菌株胞外蛋白总量的影响 |
| 4.4 CRISPR/Cas9 法敲除里氏木霉340554 菌株sec6 基因 |
| 4.4.1 Cas9稳转株的验证 |
| 4.4.2 Cas9稳转株与出发菌株生理生化特征对比 |
| 4.4.3 gRNA、d DNA质粒的构建 |
| 4.4.3.1 pMD18-T-g RNA-sec6 质粒的构建 |
| 4.4.3.2 pMD19-T-d DNA-sec6 质粒的构建 |
| 4.4.4 里氏木霉340554菌株原生质体制备条件的优化 |
| 5 结论与讨论 |
| 5.1 结论 |
| 5.1.1 钙离子对里氏木霉菌丝分支的影响 |
| 5.1.2 sec6基因在里氏木霉中的检测 |
| 5.1.3 sec6基因过表达对里氏木霉菌丝分支及蛋白产量的影响 |
| 5.1.4 里氏木霉Cas9 稳转株以及靶向sec6 基因的g RNA和 d DNA质粒的构建 |
| 5.2 讨论 |
| 附录1 Cas9 质粒p DHt/sk-PC图谱 |
| 附录2 sec6 过表达质粒p DHt/sk-P-sec6 图谱 |
| 附录3 pMD18-T-g RNA-sec6 质粒图谱 |
| 附录4 pMD19-T-d DNA-sec6 质粒图谱 |
| 附录5 里氏木霉sec6基因序列 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略说明 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 油菜黑胫病菌 |
| 1.2 油菜黑胫病的病原菌分布及入侵 |
| 1.3 黑胫病对油菜生产的影响 |
| 1.4 油菜黑胫病的防治措施概述 |
| 1.5 甾醇脱甲基酶抑制剂(DMI)类杀菌剂及其抗药性研究进展 |
| 1.5.1 甾醇脱甲基酶抑制剂(DMI)类杀菌剂的作用机理 |
| 1.5.2 产生DMI类杀菌剂抗药性的植物病原菌简介 |
| 1.5.3 植物病原真菌抗药性机理的研究进展 |
| 1.6 研究目的、意义与技术路线 |
| 1.6.1 研究目的、意义 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第二章 DMI类杀菌剂抗性菌株的筛选及室内敏感性测定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 样品来源 |
| 2.2.2 试剂及培养基 |
| 2.2.3 室内培养法分离油菜黑胫病菌L.maculans |
| 2.2.4 室内分离株的ITS鉴定 |
| 2.2.5 室内分离株对戊唑醇的敏感性试验 |
| 2.2.6 病原菌“孢子浴”侵染油菜植株法筛选L.maculans抗药性菌株 |
| 2.2.7 抗药性菌株对DMI类杀菌剂的室内敏感性测定 |
| 2.2.8 抗药性菌株的菌丝生长速率和产孢能力测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 室内培养法分离得L.maculans菌株对戊唑醇均敏感 |
| 2.3.2 病原菌“孢子浴”侵染油菜植株法筛选出6株L.maculans抗药性菌株 |
| 2.3.3 抗药性菌株对DMI类杀菌剂的室内抗药性水平 |
| 2.3.4 抗药性菌株的菌丝生长速率及产孢量 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 L.maculans抗药性菌株对DMI类杀菌剂的抗药性机理 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要仪器与试剂 |
| 3.2.2 CTAB法提取黑胫病菌总DNA |
| 3.2.3 靶标基因ERG11编码区及启动子区的扩增和纯化 |
| 3.2.4 ERG11编码区及启动子区基因序列的测序及分析 |
| 3.2.5 RT-qPCR试验抗药性菌株中ERG11 的相对表达量 |
| 3.2.6 ERG11 启动子区中的插入序列在L.maculans菌株中的存在情况 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 L.maculans抗药性菌株中ERG11 基因启动子区发生基因片段插入 |
| 3.3.2 ERG11启动子区中插入序列的分析 |
| 3.3.3 启动子中插入序列增加抗药性菌株中ERG11基因的表达量 |
| 3.3.4 转座子只存在于抗药性菌株的ERG11启动子中 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 L.maculans菌株的抗药性遗传分析研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 供试菌株 |
| 4.2.2 试剂及培养基 |
| 4.2.3 抗药性菌株与敏感菌株杂交及子代的分离 |
| 4.2.4 杂交子代的室内敏感性表型的判定 |
| 4.2.5 杂交子代DNA的提取 |
| 4.2.6 PCR法确认杂交子代中ERG11 启动子的遗传分离情况 |
| 4.2.7 杂交子代接种油菜子叶试验 |
| 4.2.8 Mating type PCR试验杂交子代的交配型 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 杂交子代表型的确定 |
| 4.3.2 PCR确认抗药性子代的获得了抗药性亲本菌株的ERG11 启动子区 |
| 4.3.3 通过侵染油菜子叶验证杂交子代表型 |
| 4.3.4 杂交子代的交配型及其分布 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 ERG11 基因过表达对敏感菌株DMI抗药性的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 供试菌株及试剂 |
| 5.2.2 供试培养基 |
| 5.2.3 ERG11表达载体的构建 |
| 5.2.4 重组质粒电转化农杆菌 |
| 5.2.5 农杆菌介导的黑胫病菌(L.maculans)转化 |
| 5.2.6 阳性转化株对戊唑醇敏感性的试验 |
| 5.2.7 室内培养条件下抗药性转化株中ERG11相对表达量的测定 |
| 5.2.8 转化株的生物学特性与致病力试验 |
| 5.2.9 ERG11 启动子驱动GFP基因转化敏感菌株 |
| 5.2.10 戊唑醇敏感性与ERG11相对表达量之间的相关性分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 过表达载体的获得及验证 |
| 5.3.2 阳性转化株对戊唑醇的室内敏感性降低 |
| 5.3.3 抗药性转化株中ERG11基因的表达量增加 |
| 5.3.4 抗药性转化株的生物学特征及致病力 |
| 5.3.5 ERG11 启动子能驱动绿色荧光蛋白(GFP)基因在敏感菌株中表达 |
| 5.3.6 L.maculans菌株EC_(50)值与ERG11 相对表达量之间的相关性 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第六章 靶标基因点突变对敏感菌株DMI抗药性的影响初探 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 供试菌株及试剂 |
| 6.2.2 目的基因的扩增及表达载体的构建 |
| 6.2.3 农杆菌介导L.maculans敏感菌株遗传转化 |
| 6.2.4 抗药性转化株的筛选 |
| 6.2.5 抗药性转化株的生物学特性及致病力试验 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 过表达载体的获得及验证 |
| 6.3.2 ERG11 点突变基因(ERG11-PM)转化株的戊唑醇敏感性显着降低 |
| 6.3.3 抗药性转化株生物学特性及致病力无显着性变化 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 本文研究的背景和意义 |
| 1.1.1 木材腐蚀的危害 |
| 1.1.2 木材腐朽的类型 |
| 1.1.3 本论文的立题依据 |
| 1.2 木材腐朽菌的简介 |
| 1.2.1 木材腐朽菌的概况 |
| 1.2.2 木材腐朽菌的种类 |
| 1.3 木材腐朽菌的鉴定 |
| 1.3.1 菌株的鉴定方法 |
| 1.3.2 技术研究进展 |
| 1.3.3 木材腐朽菌的研究进展 |
| 1.4 本论文的研究内容 |
| 2 木材腐朽真菌的分离与纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验试剂与仪器 |
| 2.1.2 实验菌株 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 筛选方法 |
| 2.2.2 培养方法 |
| 2.2.3 木材腐朽真菌的分离纯化 |
| 2.2.4 木材腐朽真菌的基本形态观察分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 木材腐朽真菌的分离 |
| 2.3.2 木材腐朽真菌的生长情况 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 提取木材腐朽真菌DNA方法的选择 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验试剂与仪器 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 基因组的提取 |
| 3.2.2 木材腐朽真菌的DNA纯度分析与对比 |
| 3.2.3 琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 DNA的获取 |
| 3.3.2 DNA纯度分析及对比 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 木材腐朽真菌的分子生物学和形态学分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验仪器与试剂 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.2. 实验方法 |
| 4.2.1 培养方法 |
| 4.2.2 PCR扩增及纯化 |
| 4.2.3 分子生物学鉴定 |
| 4.2.4 形态学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 PCR产物扩增分析 |
| 4.3.2 分子生物学鉴定 |
| 4.3.3 形态学分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 胶孢炭疽菌和橡胶树炭疽病 |
| 1.2 真菌致病机理研究进展 |
| 1.2.1 真菌侵染结构 |
| 1.2.2 胞外水解酶 |
| 1.2.3 毒素 |
| 1.2.4 效应蛋白 |
| 1.2.5 胶孢炭疽菌的致病机理研究 |
| 1.3 丝状真菌的遗传转化研究进展 |
| 1.3.1 CaCl_2-PEG介导转化法 |
| 1.3.2 基因枪法 |
| 1.3.3 电激转化法 |
| 1.3.4 限制性内切酶介导转化法 |
| 1.3.5 根癌农杆菌介导转化法 |
| 1.4 根癌农杆菌介导真菌遗传转化研究进展 |
| 1.4.1 根癌农杆菌介导真菌转化的原理 |
| 1.4.2 根癌农杆菌转化的应用 |
| 1.4.3 影响根癌农杆菌介导真菌转化效率的因素 |
| 1.5 T-DNA插入位点的鉴定方法 |
| 1.5.1 反向PCR |
| 1.5.2 接头PCR |
| 1.5.3 热不对称PCR |
| 1.5.4 高效热不对称PCR |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株及载体 |
| 2.1.2 抗生素和试剂配置 |
| 2.1.3 培养基配置 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.0 氯嘧磺隆抗性基因扩增 |
| 2.2.1 琼脂糖凝胶PCR产物回收 |
| 2.2.2 TA克隆 |
| 2.2.3 碱裂解法提取质粒 |
| 2.2.4 双元载体农杆菌制备方法 |
| 2.2.5 ATMT遗传转化方法 |
| 2.2.6 胶孢炭疽菌遗传转化条件的优化 |
| 2.2.7 转化子的PCR检测 |
| 2.2.8 突变体的致病力鉴定 |
| 2.2.9 突变体T-DNA插入位点侧翼序列的克隆 |
| 2.2.10 侧翼序列分析 |
| 2.2.11 CgFADBP敲除载体的构建 |
| 2.2.12 胶孢炭疽菌原生质体转化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 双元载体的改造 |
| 3.1.1 氯嘧磺隆抗性基因的扩增 |
| 3.1.2 双元载体pCAMBIA1300-SUR的构建 |
| 3.1.3 pCAMBIA1300-SUR转化不同农杆菌菌株 |
| 3.2 农杆菌介导的遗传转化体系的优化 |
| 3.2.1 不同农杆菌菌株对转化的影响 |
| 3.2.2 AS预培养浓度对转化的影响 |
| 3.2.3 胶孢炭疽菌孢子浓度和农杆菌浓度对转化的影响 |
| 3.2.4 共培养时间对转化的影响 |
| 3.2.5 AS共培养浓度对转化的影响 |
| 3.3 胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及筛选 |
| 3.3.1 胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建 |
| 3.3.2 突变体库抗性转化子的PCR鉴定 |
| 3.4 胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的表型筛选 |
| 3.5 T734和T735突变株T-DNA插入位点侧翼序列克隆与分析 |
| 3.6 T735插入位点基因半定量RT-PCR分析 |
| 3.7 CgFADBP敲除突变体的构建及致病性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 琼脂糖凝胶片段回收 |
| 附录二 大肠杆菌转化 |
| 附录三 碱裂解法提取质粒 |
| 附录四 热激法农杆菌转化 |
| 附录五 TRIzol法提取真菌RNA |
| 攻读硕士学位期间已发表论文 |
| 致谢 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试真菌及其培养 |
| 1.2 试验试剂 |
| 1.3 真菌基因组DNA的提取 |
| 1.4 PCR扩增检测 |
| 1.5 正交试验设计 |
| 1.5.1 考察因素及水平的设置 |
| 1.5.2 正交试验方案设计 |
| 1.6 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 正交试验设计及序列扩增结果 |
| 2.2 正交试验方差分析 |
| 2.3 单因素统计量及配对比较表 |
| 2.3.1 菌体量 |
| 2.3.2 破壁 |
| 2.3.3 抽提 |
| 2.3.4 沉淀 |
| 3 讨论与结论 |
