潘光照[1]（2018）在《家蚕Cathepsin L的鉴定及功能初探》文中研究表明蛋白酶是生物体内蛋白质降解的主要参与者,组织蛋白酶（cathepsin）是广泛存在于各种动植物组织细胞内（特别是溶酶体部分）的一类蛋白酶,并在所有生物体中均扮演着非常重要的角色。对组织蛋白酶最初的观点认为其仅仅是作为一种蛋白酶而发挥作用,但是近年来随着研究的不断深入,组织蛋白酶已被认为是木瓜蛋白酶超家族中最重要的组分,因为它们在细胞蛋白质降解中发挥重要的作用,此外,组织蛋白酶为一个庞大的蛋白酶家族群,拥有几十个家族成员,其功能也不尽相同。组织蛋白酶L（Cathepsin L）,它是一种半胱氨酸蛋白酶,并且作为木瓜蛋白酶家族的主要成员,其参与了许多的生理过程,例如,组织重塑,牙齿运动,肿瘤发生发展及免疫等。目前,有关昆虫组织蛋白酶的研究明显滞后于哺乳动物,尤其是有关家蚕组织蛋白酶的研究,仍处于起步阶段。家蚕作为鳞翅目昆虫的典型代表生物模型,对昆虫的研究具有极大的指导作用。因此,本研究,我们选取在家蚕中研究组织蛋白酶L（BmCathepsin,BmCat L）基因,这为进一步揭示组织蛋白酶L基因的功能以及作用机理非常必要。本研究通过家蚕基因组数据库（Silkworm Genome Database）、NCBI数据库以及EST数据库等综合分析,运用RACE技术成功获得了该基因的两个不同剪切体;利用相关软件对其进行了生物信息学的分析和进一步鉴定;通过实时荧光定量PCR对该基因在家蚕不同龄期以及不同组织的表达情况进行了检测分析;作为一种蛋白酶,同时也对其内外源酶活性以及影响因素进行了测定;最后,为进一步探索Bm Cat L的功能,通过活体攻毒实验,揭示其在家蚕免疫调控中可能具有的作用。主要研究成果总结如下:1.BmCaL全长克隆及生物信息学分析利用家蚕基因组数据库、NCBI以及日本家蚕数据库等在线工具对Cathepsin L基因进行基本的信息比对以及分析,设计引物,利用RACE技术,成功克隆得到家蚕Cathepsin L全长cDNA序列。通过比对分析发现,家蚕Cathepsin L存在两种长度不同的剪切体形式,分别命名为BmCathepsin L-L（BmCat L-L）和BmCathepsin L-S（BmCat L-S）。两种剪切体均含有完整的开放性阅读框（ORF）,其大小分别为1664bp和687bp,分别编码556和228个氨基酸,预测蛋白分子量为62.471KDa和26.132 KDa,理论等电点为4.86和4.57。该基因的两种剪切体的预测蛋白结构非常相似,均有一个组成完全相同的信号肽、一个组织蛋白酶L典型的Inhibitor129结构域和PeptC1结构域。将该基因的不同剪切体与其他物种进行比对分析,然后构建NJ进化树,结果显示该基因在长期进化过程中极高的保守性。通过Robetta软件计算预测该基因蛋白的三维结构,再运用蛋白数据库进行比对,结果显示该基因与黄粉虫中肠蛋白组织前酶L的三维结构非常相似,预测该蛋白酶在蛋白消化降解方面所具有的功能。2.BmCat L的表达分析通过qRT-PCR技术对该基因在家蚕幼虫L5D3不同组织和不同龄期血液组织蛋白酶L基因的表达情况进行检测。各组织表达结果显示BmCat L-L基因和BmCat L-S均在血液中高量表达,两剪切体在头部组织中低量表达,BmCat L-L在精巢中有少量表达,此外两者在其他组织中几乎检测不到其表达量。为了进一步研究血液的这种特异性高量表达,针对不同龄期的血液组织进行了定量检测,结果显示从幼虫L4D2至PP2的过程中,BmCat L均维持在一个相对较高的表达水平,并随着变态进程的推进两种剪切体的表达变化有着明显的差异性变化,BmCat L-S在幼虫L4M时表达量达到了一个峰值;而BmCat L-L则在L4D4时表达量同样达到一个峰值,随后BmCat L-S的表达量会随着龄期的变化逐渐降低,最后趋近于不表达;相对BmCat L-S而言,BmCat L-L的表达量也会随着龄期的变化而降低,但其表达水平却始终维持在一定的表达范围内。通过对两种不同剪切体于血液组织不同龄期表达谱的检测分析,预测BmCat L在家蚕血液中处于高表达的状态,并在变态发育过程中似乎扮演着表达互补的作用,且可能影响家蚕的变态和发育,但具体机制还有待进一步验证。3.BmCat L原核表达、重组蛋白纯化及抗体制备选取该基因ORF的特异性片段,构建原核表达载体。在不同温度和IPTG浓度下摸索诱导得到最佳表达条件,选择在该条件下进行大规模诱导,经高压破菌,运用Ni+亲和层析法纯化重组蛋白;为了进一步验证纯化后的重组蛋白为目标蛋白,运用His抗体进行Western blot杂交实验验证,并成功获得了相应大小的目的条带。最后,利用纯化的重组蛋白对昆明鼠进行多次免疫,获得该基因的抗血清蛋白,通过ELISA、免疫荧光和免疫印迹实验均验证了该抗体的可用性,这为后期功能以及机制的研究奠定了基础。4.BmCat L的活性、稳定性以及影响因素测定取L5D3家蚕血液组织提取组织蛋白酶,然后对其内源性组织蛋白酶的活性及稳定性特征进行测定分析。利用不同组织蛋白酶的特异性检测底物对家蚕血液组织不同组织蛋白酶的活性进行测定,发现被检测的三种组织蛋白酶（B、L、H）活性均受温度、pH等因素的影响;热稳定性测定结果显示,当温度高于75℃时,被检测的三种酶几乎都处于活性丧失状态,当将酶置于常温状态下,其活性也随着时间逐渐变弱。综合测定结果显示组织蛋白酶B是一种偏酸活性酶,最适pH大约为5.5,最适温度为37℃,组织蛋白酶L最适pH约为4.0-5.0,最适温度为37℃,而组织蛋白酶H最适pH为8.0,最适温度为37℃。通过利用相同的方法对纯化后的重组组织蛋白酶L进行了检测,发现重组蛋白酶只对其特异性反应荧光底物Z-phe-Arg-Nmec具有酶活性功能,进一步说明纯化所得的蛋白酶为具有活性的组织蛋白酶L;对酶活性以及稳定性的检测结果均显示出外源组织蛋白酶L具有同内源组织蛋白酶L相似的酶学特征。以上的研究结果将为家蚕蚕病、尤其是血液疾病的防治及检测提供理论参考,同时,我们研究工作也丰富了家蚕组织蛋白酶酶学研究的内容,作为对鳞翅目的代表家蚕进行研究,对其它鳞翅目昆虫在该领域的研究极具指导意义。5.BmCat L功能初步探索组织蛋白酶L作为一类蛋白酶,除了具有消化降解的作用外,另据大量研究报道,其在生物体免疫中具有不可或缺的作用。然而,通过前面的研究已然显示,组织蛋白酶L基因在家蚕血液组织中存在着特异性地高量表达,血液组织是昆虫最为重要的免疫器官,许多研究报道其组份对于昆虫的免疫调控起着至关重要的作用,家蚕作为鳞翅目昆虫,如同其他昆虫一样,先天性免疫是它们抵御病原体的入侵,并维持自身稳态最为关键的防御体制。那么,组织蛋白酶L在家蚕血液组织中的这种高量表达是否也预示着其免疫相关的功能?其实这并未知晓。于是通过选择不同的致病菌和致病模式因子,对家蚕进行了活体攻毒验证,结合RT-PCR实时监测,结果显示,在保证蚕体安全剂量的情况下,BmCat L的表达量会首先随着攻毒时间的变化而达到一个峰值,随后,其表达量又会回到一个正常表达的水平。通过比较分析,BmCat L的两种剪切体趋势基本一致,推测其可能参与家蚕的血液免疫调控。
程杏安,林贤伟,蒋旭红,刘展眉,钟国华,胡美英[2]（2018）在《草地贪夜蛾组织蛋白酶L的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备》文中指出【目的】克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的组织蛋白酶L（cathepsin L,CatL）基因,分析该基因的序列特征并制备该酶多克隆抗体,为探析其生理功能奠定基础。【方法】根据甜菜夜蛾Spodoptera exigua的组织蛋白酶L基因开放阅读框（ORF）序列两端直接设计引物克隆草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因。利用生物信息学软件分析该基因的序列特征,利用ClustalX2软件进行同源比对和进化分析,利用同源建模预测该酶三维结构。通过原核表达重组蛋白,多次免疫新西兰大白兔制备该酶多克隆抗体。【结果】克隆获得了草地贪夜蛾的组织蛋白酶L基因SfCatL（GenBank登录号:HQ110065）,ORF序列长1 035 bp,编码344个氨基酸,预测N-末端含有长度为16个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为36.8 kD,等电点为6.69。SfCatL氨基酸序列与其他13个物种的组织蛋白酶L氨基酸序列比较有53.7%96.8%的一致性,与甜菜夜蛾组织蛋白酶L氨基酸序列一致性最高,达96.8%。同源建模预测表明,SfCatL折叠成紧密而稳定的元宝状结构,含3个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白的表面。原核表达、纯化SfCatL蛋白制备抗血清,其效价超过1∶40 000,Western blot鉴定结果表明抗血清与草地贪夜蛾Sf9细胞SfCatL蛋白能够特异性结合。【结论】获得了草地贪夜蛾SfCatL完整ORF序列,分析了其特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,成功获得多克隆抗体。本研究为进一步研究该基因的功能并开发组织蛋白酶抑制剂类杀虫剂提供理论依据。
黄媛,王艺磊,张子平,岳亮,冯建军,郭松林,林鹏[3]（2017）在《日本囊对虾组织蛋白酶B基因的原核表达及纯化》文中指出采用原核表达的方法得到日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）组织蛋白酶B基因的重组蛋白。以日本囊对虾卵巢组织为试验材料,采用双标签（GST和His）的方法,用带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点以及6×His-tag的特异引物扩增Cathepsin B的开放阅读框,并连接至表达质粒pGEX-4T-2中。将重组表达质粒导入大肠杆菌BL21中,在30℃条件下,用终浓度为1mmol/L的IPTG（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside）诱导5h得到最佳诱导量,His亲和柱进行纯化,纯化蛋白依次于8、6、4、2、1、0 mol/L尿素缓冲液中梯度透析,得到复性后可溶于水的重组蛋白,经SDS-PAGE检测,得到单一条带,其分子质量约为63ku。取冻干后的蛋白制备多克隆抗体,抗体效价达50 000,经Western blot检测,同样可在63ku处得到该条带,表明制备的组织蛋白酶B（CB）多克隆抗体具有特异性,该抗体可特异识别CB蛋白。
黄媛[4]（2016）在《Cathepsin B在日本囊对虾卵巢发育过程中的功能研究》文中提出组织蛋白酶B（Cathepsin B,CB）是溶酶体半胱氨酸蛋白酶中特殊的一员,既具有内切酶（Endopepdidase）的活性又具有羧基二肽酶（Dipeptidyl carboxypeptidase）的活性。广泛存在水生动物各组织中,不同物种中会有表达差异。CB在卵巢中的高表达表明其在卵巢发育、卵子形成以及胚胎发育中的重要功能,而在受病毒或细菌应激的条件下,血细胞等免疫相关器官中CB的高表达表明其参与到免疫应激的过程中。CB无论在脊椎动物还是无脊椎动物中均起到了关键作用。本课题组前期已通过差异蛋白组学的方法得到日本囊对虾（Marsupenaeus japonicas）卵巢特异表达蛋白CB,并克隆的到了日本囊对虾CB（MjCB）的cDNA全长。在此基础上,采用基因组步移结合常规PCR等方法克隆得到MjCB的基因组全长和5’调控区。采用重组质粒的构建与诱导表达制备出特异的MjCB多克隆抗体。通过日本囊对虾成体RNA干扰实验研究了卵巢发育相关基因在MjCB被干扰情况下,在卵巢组织中的表达情况。本实验还分析了在单侧眼柄切除实验条件下,卵巢组织中相关基因在卵巢中的表达情况。现将主要研究结果总结如下:（1）采用基因组步移（Genome walking）与常规PCR结合的方法,首次克隆得到MjCB的基因组全长3122 bp,由四个外显子和三个内含子组成,第一个外显子只有20 bp,第一个内含子长达1440 bp,内含子的剪切遵循典型的“GT-AG”规则,翻译起始密码子ATG位于第二个外显子中。（2）运用生物信息学软件对5’调控区进行分析,预测出可能存在的核心启动子区和转录起始位点,一个CpG岛,Oct-1、F-kappaB、SP1、AP-1、GATA-1等29个转录因子结合位点。（3）采用His和GTS双标签的方法,成功构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2-MjCB,并诱导其大量表达,成功复性为可溶性的蛋白,纯化后制备出可用于Western Blot检测的特异的多克隆抗体。（4）通过实时荧光定量PCR（Quantitive Real-time PCR,qPCR）的方法研究MjCB在卵巢发育至II期的日本囊对虾不同组织中的表达情况,结果显示MjCB只在此发育阶段的卵巢组织中高表达,与其它组织相比差异极显着（P<0.01）。（5）通过体外重组制备长约400650 bp的双链RNA片段（Double Stranded RNA,dsRNA）作为干扰片段用于MjCB的RNA干扰实验,采用qPCR来确定MjCB在干扰后0h、6 h、12 h、24 h和48 h卵巢组织中的表达情况,进而确定最佳干扰时间点为12 h。（6）在干扰实验相关基因的研究中,我们采用了2个对照组,即注射dsEGFP组和注射生理盐水组,对照组之间可以相互矫正以确保实验数据的可靠性。在CB下调的情况下,我们采用qPCR的试验方法发现,卵黄原蛋白（Vitellogenin,Vg）基因表达显着下调（P<0.05）、组织蛋白酶C（Cathepsin C,CC）基因显着上调（P<0.05）、组织蛋白酶L（Cathepsin L,CL）基因未受到影响（P>0.05）。（7）在单侧眼柄切除组中,CB基因显着下调（P<0.05）,Vg、CC和CL基因的表达与对照组相比差异不显着（P>0.05）。
苏晶晶,陈思源,张奎,余霜,李钰添,梁航华,赵羽卒,晁会娟,崔红娟[5]（2015）在《家蚕组织蛋白酶O（BmCatO）基因鉴定及表达分析》文中研究说明【目的】克隆家蚕（Bombyx mori）蛋白酶O基因Cathepsin O（Bm Cat O）,分析其m RNA表达特征,通过原核表达、蛋白纯化和多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,为进一步探究组织蛋白酶O在家蚕变态发育中的功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆获得家蚕组织蛋白酶O的全长c DNA序列,然后采用RT-PCR对其时空表达特征进行研究。从NCBI下载其他物种组织蛋白酶O基因序列,利用Clustalx和MEGA 6.0软件进行同源比对和进化分析。选取特异性较高的片段设计特异性引物,将PCR扩增产物连接至PET32a质粒,转化至E.coil表达菌株Rosetta（DE3）,经IPTG诱导获得组织蛋白酶O重组蛋白,然后利用Ni+亲和层析方法对重组蛋白进行纯化,最后多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。【结果】家蚕组织蛋白酶O基因存在于家蚕第14号染色体上,scaffold为nscaf2943,基因编号BGIBMGA009231。该基因有两种剪切形式,剪切体1开放阅读框（ORF）全长为1 071 bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子量36 k D,等电点8.594;剪切体2 ORF全长为942 bp,编码313个氨基酸,预测蛋白分子量40 k D,等电点7.951。两种剪切体均有6个外显子和5个内含子构成,剪切体2的第六外显子出现部分缺失。两种剪切体编码的蛋白结构相似,均含有信号肽、Inhibitor129和Pept-C1结构域。进化分析结果表明,无脊椎动物组织蛋白酶单独聚为一类,且家蚕组织蛋白酶O与同为鳞翅目成员的二化螟（Chilo suppressalis）组织蛋白酶O最为接近。RT-PCR结果显示该基因特异性持续表达于幼虫血细胞,剪切体1的表达水平明显高于剪切体2,但这两种剪切体在幼虫血细胞发育时期表达趋势一致。构建家蚕组织蛋白酶O原核表达系统,利用亲和层析纯化获得高纯度的家蚕组织蛋白酶O重组蛋白,并利用纯蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA显示其效价高达到1﹕1 280 000。Western印迹结果表明,该抗血清可以特异性识别家蚕组织蛋白酶O重组蛋白。【结论】获得了家蚕组织蛋白酶O基因的完整c DNA序列及表达特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,通过多次免疫新西兰大白兔成功获得抗体。
于蕾[6]（2010）在《海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化、抗体制备及其应用》文中研究表明海参具有极强的自溶能力,当受到外界刺激时即发生降解。研究发现存在于海参体壁和肠道中的一系列内源性组织蛋白酶是海参自溶的主导因素。因此,对海参组织蛋白酶B的研究将为调控海参自溶提供理论依据。本文首先研究了海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化及部分酶学性质,然后对组织蛋白酶B进行抗体制备,并用紫外照射诱导海参自溶,对海参自溶前后体壁和肠道中组织蛋白酶B的分布进行了初步研究。新鲜海参肠经含 5 mmol/L L-Cys、1 mmol/L EDTA、0.2％Triton X-100 的 50 mmol/L pH 5.0的NaAc-HAc缓冲液匀浆破碎,浸提7 h后,80%硫酸铵饱和度盐析,再经DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换层析、Sephadex G-75和TSK-GEL 3000 SWxl凝胶层析获得纯化的组织蛋白酶B。组织蛋白酶B经一系列柱层析纯化81.26倍。纯化后的酶经Native-PAGE测定得到一条带,经SDS-PAGE测定得到两条带,分子量约为23 kDa和26 kDa。以Z-Arg-Arg-MCA为组织蛋白酶B的特异性底物,经测定纯化酶的最适pH和温度分别为5.5和45℃,偏酸性范围酶的稳定性好,不高于55℃的温度下酶活力稳定。Ca2+、Mg2+对该酶抑制微弱,Mn2+、Fe2+和Fe3+对该酶有一定的抑制作用,Ni2+、Cu2+、Zn2+则能完全抑制该酶的活性。巯基抑制剂E-64和碘乙酸对酶完全抑制,而巯基激活剂DTT、L-Cys和EDTA对酶则具有一定激活作用,说明纯化得到的酶分子含巯基基团;丝氨酸蛋白酶抑制剂（PMSF、TI）和金属蛋白酶抑制剂（1,10-菲啰啉）对酶抑制明显;作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂的抗痛素和亮肽酶素均强烈抑制酶活,其中抗痛素可完全抑制酶活,说明纯化出的酶属于半胱氨酸蛋白酶。纯化后的酶作为抗原免疫大鼠制备抗体,抗体经Protein G 2mL亲和层析得到纯化,由SDS-PAGE电泳检测,纯化出的抗体IgG纯度达90%以上。由免疫组化技术对海参自溶前后体壁和肠道中组织蛋白酶B的分布进行了初步研究,结果表明紫外诱导自溶的海参体壁及肠道组织蛋白酶B均广泛存在。
赵艳艳,刘建兵,罗梅浩,郭线茹,原国辉[7]（2008）在《烟夜蛾组织蛋白酶B酶原基因的克隆、序列分析和原核表达》文中研究指明利用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）技术从烟夜蛾Helicoverpa assulta（Guene）雌虫卵巢中扩增得到了组织蛋白酶B酶原基因（cathepsin B,CB）cDNA片段,将其克隆至pMD19-T载体。测序结果表明,该片段长度为1017bp,含有组织蛋白酶B酶原基因完整开放阅读框架（ORF）（Gen Bank登录号:EF154237）。序列分析结果显示:烟夜蛾组织蛋白酶B（HassCB）编码338个氨基酸残基,预测N-末端含有长度为21个氨基酸残基的信号肽序列;去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为35.5kDa,等电点为5.96。氨基酸序列比对结果表明,HassCB与其他昆虫的组织蛋白酶B酶原氨基酸序列有较高的一致性。将去除信号肽序列的HassCB（HassCBa）重组到表达载体pGEX-4T-1中,并转入原核细胞中表达,SDS-PAGE和Western印迹分析表明:该基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约61kDa的目的条带,与预测的融合蛋白分子量相符。用该基因制备多克隆抗体并测得该抗体对重组表达的HassCBa的效价为1∶51200。通过免疫印迹检测证实,此抗体既能识别重组表达的HassCBa,又能识别烟夜蛾卵巢匀浆液中的HassCB。
王晓梅[8]（2008）在《文蛤（Meretrix meretrix）幼虫生长发育相关基因的克隆和功能分析》文中研究说明贝类养殖是我国海水养殖业中最重要的组成部分之一。贝类人工大规模养殖中的关键环节是种苗的人工繁育,早期幼虫能否正常生长发育,对幼虫变态和变态后生长率及成活率有很大的影响,直接关系到生产产量和经济效益,所以,了解幼虫发育机制对于生产实践具有重要的指导意义。文蛤（Meretrix meretrix）是一种在东亚各国沿海和滩涂地区广泛分布的双壳贝类,是我国一种重要的经济品种。本论文以文蛤幼虫为研究对象,分别对文蛤幼虫发育过程中贝壳形成相关的铁蛋白（MmeFer）、营养及变态相关的组织蛋白酶B（MmeCB）及变态过程中细胞凋亡相关的caspase三个基因进行了克隆,分析了基因及编码蛋白在担轮幼虫期（L1）、D形幼虫期（L2）、壳顶幼虫期（L3）和稚贝期（L4）的时空表达特征,解析了其可能的功能,并研究了相应酶类的特异性抑制剂作用对幼虫发育过程的影响,进行了目标蛋白的功能验证,详述如下:研究结果显示,在文蛤胚胎发育到原肠胚时放入不含铁离子的人工海水中培养,发育成无壳的畸形,随着人工海水中铁离子添加浓度的升高,幼虫长出壳状组织接近正常状态;而发育到L1期幼虫放入不含铁离子的人工海水中培养却可以发育出正常的壳,推测铁和铁代谢相关蛋白在幼虫贝壳初始形成有重要的作用。根据构建的文蛤幼虫cDNA文库中提供的序列信息,从文蛤中克隆了与铁离子代谢密切相关的铁蛋白（MmeFer）的全长cDNA序列;通过Real time PCR发现,MmeFer mRNA的表达量在贝壳形成前后有明显改变;整体原位杂交结果显示MmeFer mRNA在L1期的表达部位刚好是贝壳生成的起始部位,推断文蛤铁蛋白与文蛤幼虫贝壳初始形成密切相关。利用文蛤幼虫cDNA文库中的EST信息在幼虫中克隆到文蛤组织蛋白酶B（MmeCB）全长cDNA序列;通过整体原位杂交分析发现MmeCB mRNA在L2至L4期幼虫的消化腺部位表达,而且在L2期的幼虫表皮也有表达,说明MmeCB可能和幼虫消化相关,而且可能参与幼虫从表皮摄取营养的过程。利用MmeCB特异性抑制剂（CA074Me）处理饥饿幼虫,发现其生长受到明显抑制,验证了MmeCB参与幼虫表皮营养代谢的推论。利用免疫组织化学技术,研究了MmeCB蛋白在文蛤幼虫中的时空分布,发现其在L2期幼虫表面和胃部有阳性信号,而在L3期,MmeCB在幼虫面盘基部有强烈的表达,提示MmeCB在文蛤幼虫中不仅起到营养的作用,而且可能和幼虫附着变态有关。利用CA074Me分别处理文蛤胚胎和变态期幼虫,发现抑制MmeCB的活性对胚胎发育和幼虫变态都有显着影响。研究结果提示MmeCB在幼虫发育各阶段均具有重要的生物学功能。根据caspase在不同物种中的保守区域设计简并引物,在文蛤幼虫中扩增到cDNA序列片段;检测有活性的caspase在文蛤幼虫各发育时期的分布部位,发现其在L1至L3期幼虫中都有分布,说明整个幼虫形态变化过程中都有caspase的参与;细胞凋亡检测结果显示,幼虫主要发生细胞凋亡的部位在L3期幼虫的面盘,即变态过程中要退化的器官,说明细胞凋亡可能是文蛤幼虫变态过程中面盘退化的主要机制;用caspase特异性抑制剂处理变态前幼虫,发现幼虫变态率下降,初步验证了caspase在文蛤幼虫变态过程中的作用。通过对上述三种基因的研究,分别探讨了文蛤幼虫发育阶段中的几个主要事件（L1期到L2期的贝壳形成、L2到L3期的幼虫营养摄食及L3到L4期的附着变态）相关的基因及其功能,为研究贝类生长发育调控的分子机理提供了新的线索。
郭红彦[9]（2007）在《银杏营养贮藏蛋白质的分离鉴定及特性研究》文中研究表明本文以银杏（Ginkgo biloba L.）不同生长时期韧皮部薄壁组织超微结构的解剖学研究为突破口,应用酶标和胶体金免疫细胞定位技术,结合组织化学和生物化学分析,进行了银杏营养贮藏蛋白质的准确定位;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（SDS-PAGE）进行了银杏营养贮藏蛋白质的组分分析、分离纯化和糖蛋白质特性研究,确定了银杏营养贮藏蛋白质的主要组分;阐明了银杏营养贮藏蛋白质季节性动态变化规律及与银杏生长发育的相关性;揭示了银杏营养贮藏蛋白质的形成、积累、降解的基本规律。这对于提高银杏氮素养分利用率,指导适时合理施肥以及今后采用转基因技术培育高氮素利用率的优良品种等方面均具有重大理论价值和实践意义。主要结论如下:银杏营养贮藏蛋白质在枝条和根系的韧皮薄壁细胞、韧皮射线细胞、木射线、次生韧皮部与初生木质部之间的细胞中均有分布。但以韧皮薄壁细胞的液泡最为丰富。银杏韧皮薄壁细胞内的营养贮藏蛋白质在细胞质内合成,由内质网膨大的槽库、质膜内折或高尔基体小泡发育形成贮藏蛋白质的液泡。液泡蛋白质主要以不定形块状、絮状、颗粒状和均一细沙状等四种形式存在。银杏营养贮藏蛋白质主要存在于枝条的皮层和木质部中;当年生枝条含量高于二年生枝条,皮层的含量高于木质部;银杏营养贮藏蛋白质的动态变化分为积累和降解两个阶段,5月份随着新梢伸长及新生叶片的形成,新梢开始积累营养贮藏蛋白质,在生长季节贮藏蛋白质含量不断增加,在12月份含量达到最高,在整个越冬期间一直保持高含量水平,直到翌年春季芽萌发时,贮藏蛋白质迅速降解、转移再利用,满足新梢生长发育的要求,到4月14日枝条中贮藏蛋白质几乎完全降解。银杏枝条贮藏蛋白质组分可分为高分子量、中分子量和低分子量三类;同一分子量的营养贮藏蛋白质对应不同的等电点,从蛋白质的分子量和等电点两方面确定以下成份为银杏的营养贮藏蛋白质:（36.4,5.56）（36.3,4.57）（36.1,5.35）（36.4,5.49）（36.2,6.46）（36.2,5.02）（36,6.33）（36,6.74）（36.1,4.62）（36.4,5.19）（36,6.2）（36,6.43）（32.3,5.15）（32.4,4.66）（32.1,6.6）（32.1,6.3）（32.2,4.74）（32,5.97）（32.1,6.45）（32,5.75）。银杏营养贮藏蛋白质具有典型的糖蛋白特性。运用制备型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并制备了银杏32kDa和36kDa两种营养贮藏蛋白质抗原,分别四次免疫新西兰大白兔,采血提取抗血清后,双向琼脂免疫扩散试验检测,成功获得了银杏32kDa和36kDa两种营养贮藏蛋白质的多克隆抗体。间接酶标免疫光镜细胞化学定位和胶体金免疫电镜细胞化学定位均证明36kDa和32kDa蛋白质是银杏的主要营养贮藏蛋白质。
邵红莲[10]（2006）在《棉铃虫功能基因重组病毒杀虫剂研究及棉铃虫细胞系的建立》文中研究说明棉铃虫是鳞翅目夜蛾科昆虫，因摄食杂，食量大，繁殖力强，严重危害我国农业经济。用化学药物控制害虫，害虫会逐渐产生抗药性，给防治带来更大的困难，同时化学药物也给人类健康带来不利。通过体内、体外研究方法，深入掌握害虫发育规律及机理，从生物学角度设计扰乱害虫生长或借用天然病原体控制害虫的生物防治具有针对性强，特异性高，对人类及环境无污染等优点，具有广阔的发展前景。 本论文在实验室前期工作基础上，进行了两种棉铃虫功能基因重组病毒杀虫剂的实验研究，为筛选新的重组病毒候选基因提供实验证据。论文还探索建立了三种体外连续传代的棉铃虫细胞系，为进一步在体外研究棉铃虫活体细胞的激素调控、病毒感染、细胞凋亡等分子生物学机制奠定了基础。现将论文内容概括如下： 第一部分：棉铃虫功能基因重组病毒杀虫剂研究 杆状病毒中绝大部分是昆虫特异性病原，因不感染脊椎动物，是理想的控制害虫的生物“工具”。然而根据研究得知，野生型杆状病毒具有杀虫谱窄，杀虫速度慢的缺点。遗传改造病毒，选用外源基因构建重组病毒，使重组病毒感染虫体后除了病毒的毒杀作用外还通过外源基因的持续表达双重干扰昆虫，以加快害虫的死亡、提高害虫的死亡率，大大减少农林业的经济损失。已报道了多种基因重组病毒，如蝎毒素、螨毒素、利尿激素、保幼激素酯酶等基因的重组病毒，其杀虫效果虽都优于相应的野生型病毒，但仍不理想。新的安全高效的基因重组病毒候选基因需要探索和发现。 棉铃虫激素接受子3（Helicoverpa hormone receptor 3，HHR3）是蜕皮激素直接诱导的棉铃虫蜕皮调节转录因子激素接受子3，是棉铃虫蜕皮级联反应过程的关键调控因子，HCB（Helicoverpa armigera cathepsin B-like proteinase）是参与棉铃虫胚胎发育及成虫脂肪体降解的半胱氨酸蛋白酶。实验室前期工作已将两个基因分别定点插入双启动子表达载体pFastBacDUAL（即p10启动子和多角体蛋白基因启动子，其中p10启动子下游已插入了绿色荧光蛋白基因）的多角体蛋白基因启动子下游，本论文在紧接侯选基因后面再插入来自AcMNPV的多角体基因，转座获得阳性重组菌株后，分别
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 Cathepsins的研究进展 |
| 1.1.1 Cathepsins概述 |
| 1.1.2 Cathepsins的结构 |
| 1.1.3 Cathepsins的功能 |
| 1.2 昆虫Cathepsins的研究进展 |
| 1.2.1 果蝇Cathepsins的研究进展 |
| 1.2.2 棉铃虫组织蛋白酶研究 |
| 1.2.3 蚊子组织蛋白酶研究 |
| 1.2.4 家蚕组织蛋白酶研究进展 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究目的和意义 |
| 2.3 主要内容 |
| 2.4 技术路线 |
| 第三章 BmCat L鉴定克隆及生物信息学分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 动物材料 |
| 3.1.2 在线工具来源 |
| 3.1.3 所用的分析软件 |
| 3.1.4 引物设计 |
| 3.1.5 主要实验仪器 |
| 3.1.6 主要试剂和耗材 |
| 3.1.7 主要试剂的配制 |
| 3.2 主要试验方法 |
| 3.2.1 家蚕组织总RNA的抽提 |
| 3.2.2 模板DNA的制备 |
| 3.2.3 c DNA模板的检测 |
| 3.2.4 BmCat L序列PCR扩增 |
| 3.2.5 BmCat L的回收 |
| 3.2.6 目的片段与载体的连接 |
| 3.2.7 目的片段的转化 |
| 3.2.8 阳性克隆的筛选和测序 |
| 3.2.9 RACE模板的制备 |
| 3.2.10 BmCat L 5’RACE和 3’RACE扩增 |
| 3.2.11 BmCat L的表达分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 BmCat L的克隆及分析 |
| 3.3.2 BmCat L的序列分析 |
| 3.3.3 BmCat L的序列比对 |
| 3.3.4 BmCat L的进化分析 |
| 3.3.5 Cathepsin L蛋白结构多重比对分析 |
| 3.3.6 BmCat L表达特征分析 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 BmCat L原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 动物材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 主要试剂的配制 |
| 4.1.5 BmCat L重组蛋白表达引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 BmCat L原核表达载体的构建 |
| 4.2.2 BmCat L诱导条件的摸索 |
| 4.2.3 BmCat L的纯化 |
| 4.2.4 BmCat L包涵体蛋白的复性 |
| 4.2.5 Anti-BmCat L抗体制备 |
| 4.2.6 BmCat L抗血清特异性及效价检测 |
| 4.2.7 免疫荧光 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 BmCat L原核表达载体的构建及鉴定 |
| 4.3.2 BmCat L原核诱导及蛋白纯化 |
| 4.3.3 BmCat L抗血清制备、效价及特异性检测 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 BmCat L酶活性及稳定性测定 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 动物材料 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂耗材 |
| 5.1.4 主要试剂的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 家蚕血液组织蛋白酶提取物的制备 |
| 5.2.2 家蚕内源性组织蛋白酶活性测定 |
| 5.2.3 家蚕内源组织蛋白酶活性影响因素的研究 |
| 5.2.4 家蚕外源重组组织蛋白酶活性、热稳定性测定及影响因素检测 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 家蚕内源组织蛋白酶酶活性、热耐受性及活性影响因素 |
| 5.3.2 BmCat L重组组织蛋白酶活性、热耐受性及活性影响因素 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第六章 家蚕Cathepsin L功能初探 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 动物材料 |
| 6.1.2 相关数据库及分析软件 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.1.4 主要试剂耗材 |
| 6.1.5 相关定量引物 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 蚕活体攻毒实验 |
| 6.2.2 BmCat L不同剪切体蛋白三级结构预测 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 病原菌诱导BmCat L-S和BmCat L-L表达 |
| 6.3.2 BmCat L蛋白结构预测及结构数据库比对 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第七章 综合与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 硕士期间发表文章及课题参研情况 |
| 致谢 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞系及主要试剂、仪器和软件 |
| 1.2 PCR引物的设计与合成 |
| 1.3 总RNA和DNA的提取 |
| 1.4 c DNA合成 |
| 1.5 草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因ORF序列的克隆与分析 |
| 1.6 同源模建草地贪夜蛾组织蛋白酶L三维结构 |
| 1.7 草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因编码区内含子的确定 |
| 1.8 草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因的原核表达 |
| 1.9 草地贪夜蛾组织蛋白酶L原核表达蛋白的可溶性分析 |
| 1.1 0 抗原的制备 |
| 1.1 1 抗血清制备与检测 |
| 1.1 2 酶联免疫吸附法 (ELISA) 测定多克隆抗体效价 |
| 1.1 3 Western bolt检验抗体特异性 |
| 2 结果 |
| 2.1 草地贪夜蛾的组织蛋白酶L基因克隆 |
| 2.2 Sf Cat L氨基酸序列同源性分析 |
| 2.3 Sf Cat L三维结构特征 |
| 2.4 Sf Cat L编码区内含子分析及其成熟肽序列的PCR扩增 |
| 2.5 原核表达载体的构建和克隆鉴定 |
| 2.6 Sf Cat L基因在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.7 Sf Cat L原核表达蛋白的可溶性分析 |
| 2.8 抗原的制备 |
| 2.9 抗血清制备与特异性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料及主要仪器 |
| 1.2 cDNA模板的制备 |
| 1.3 MjCB原核表达特异引物的设计及其ORF的扩增 |
| 1.4 pGEX-4T-2-MjCB表达重组质粒的构建 |
| 1.5 重组质粒的转化及大肠杆菌的诱导表达 |
| 1.6 表达蛋白的纯化、复性和冻干 |
| 1.7 多克隆抗体的制备及效价检测 |
| 1.8 抗体的纯化和重组蛋白的Western blot分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 cDNA模板的制备和带双酶切位点ORF的扩增 |
| 2.2 pGEX-4T-2-MjCB表达重组质粒的构建 |
| 2.3 pGEX-4T-2-MjCB诱导表达条件的优化 |
| 2.4 表达蛋白的纯化、复性和冻干 |
| 2.5 多克隆抗体的检测 |
| 3 讨论 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 组织蛋白酶家族及组织蛋白酶B的简介 |
| 1.2 组织蛋白酶B及其在水生动物中的研究进展 |
| 1.2.1 水生动物CB基因及蛋白的结构特性 |
| 1.2.2 CB基因和蛋白的表达及其功能 |
| 1.2.3 CB和其它酶类的相互作用 |
| 1.3 日本囊对虾的养殖和解剖学特征 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.5 主要研究的内容和技术路线 |
| 1.5.1 主要研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第2章 MjCB的原核表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配方 |
| 2.2 MjCB原核表达实验方法 |
| 2.2.1 卵巢RNA的提取以及cDNA模板的制备 |
| 2.2.2 MjCB原核表达特异引物的设计及其ORF的扩增 |
| 2.2.3 pGEX-4T-2-MjCB表达重组质粒的构建 |
| 2.2.4 重组质粒的转化及大肠杆菌的诱导表达 |
| 2.2.5 SDS-PAGE单向蛋白电泳 |
| 2.2.6 表达蛋白的纯化、复性和冻干 |
| 2.2.7 多克隆抗体的制备及效价检测 |
| 2.2.8 抗体的纯化和重组蛋白的Westernblot分析 |
| 2.3 原核表达实验结果 |
| 2.3.1 cDNA模板的制备和带双酶切位点ORF的扩增 |
| 2.3.2 pGEX-4T-2-MjCB表达重组质粒的构建 |
| 2.3.3 pGEX-4T-2-MjCB表达诱导条件的优化 |
| 2.3.4 表达蛋白的纯化、复性和冻干 |
| 2.3.5 多克隆抗体的检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 MjCB基因5'调控区的分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂和仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 提取日本囊对虾卵巢基因组DNA |
| 3.2.2 MjCB基因组步移特异引物的设计 |
| 3.2.3 MjCB基因组序列的克隆 |
| 3.2.4 基因组步移 |
| 3.2.5 验证所扩增的区域 |
| 3.2.6 MjCB基因组和启动子区的生物信息学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 日本囊对虾卵巢基因组DNA的提取和MjCBDNA序列的克隆 |
| 3.3.2 MjCB 5'调控区克隆以及生物信息学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 日本囊对虾MjCB基因的干扰 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验仪器和试剂 |
| 4.1.3 本实验所需引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验虾的饲养 |
| 4.2.2 干扰探针的制备 |
| 4.2.3 日本囊对虾的干扰实验 |
| 4.2.4 取样 |
| 4.2.5 实时荧光定量PCR |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 干扰片段的克隆 |
| 4.3.2 重组载体中目的片段插入方向的检测 |
| 4.3.3 体外转录制备双链RNA |
| 4.3.4 qPCR扩增效率检测 |
| 4.3.5 MjCB在无处理组各组织中的表达情况 |
| 4.3.6 MjCB在不同处理组卵巢组织中的表达情况 |
| 4.3.7 MjVg在不同处理组卵巢组织中的表达情况 |
| 4.3.8 MjCC在不同处理组卵巢组织中的表达情况 |
| 4.3.9 MjCL在不同处理组卵巢组织中的表达情况 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成果情况 |
| 0引言 |
| 1材料与方法 |
| 1.1材料与试剂 |
| 1.2方法 |
| 2结果 |
| 2.1家蚕组织蛋白酶O基因克隆 |
| 2.2家蚕组织蛋白酶O蛋白结构域分析 |
| 2.3同源与进化分析 |
| 2.4时空表达分析 |
| 2.5原核表达与蛋白纯化 |
| 2.6抗体的制备与鉴定 |
| 3讨论 |
| 4结论 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 海参 |
| 1.1.1 海参形态与生物学特性 |
| 1.1.2 海参的分布 |
| 1.1.3 海参的营养与功效 |
| 1.2 自溶酶 |
| 1.2.1 水产动物自溶酶 |
| 1.2.2 水产动物自溶酶的应用 |
| 1.3 组织蛋白酶 |
| 1.3.1 组织蛋白酶分类 |
| 1.3.2 组织蛋白酶的存在形式 |
| 1.3.2.1 组织蛋白酶的内源抑制剂复合物形式 |
| 1.3.2.2 组织蛋白酶的前体及其活性中间体形式 |
| 1.3.3 组织蛋白酶特异性底物 |
| 1.3.4 组织蛋白酶的研究进展 |
| 1.4 组织蛋白酶B |
| 1.4.1 组织蛋白酶B研究进展 |
| 1.4.2 组织蛋白酶B应用方面的研究 |
| 1.5 立题背景及意义 |
| 1.6 本论文研究的主要内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 主要实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 蛋白质含量的测定 |
| 2.2.1.1 Lowry法测定蛋白质含量 |
| 2.2.1.2 紫外分光光度法测定蛋白质含量 |
| 2.2.2 组织蛋白酶B酶活力的测定 |
| 2.2.3 不同条件对酶液的提取 |
| 2.2.4 组织蛋白酶B的分离纯化 |
| 2.2.4.1 DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换层析 |
| 2.2.4.2 Sephadex G-75凝胶层析 |
| 2.2.4.3 TSK-GEL 3000 SWx1分子排阻色谱 |
| 2.2.5 电泳方法 |
| 2.2.5.1 蛋白质凝胶电泳试剂的配制 |
| 2.2.5.2 Native-PAGE电泳 |
| 2.2.5.3 SDS-PAGE电泳 |
| 2.2.6 Cathepsin B酶学性质的测定 |
| 2.2.6.1 最适pH值的测定 |
| 2.2.6.2 最适反应温度的测定 |
| 2.2.6.3 热稳定性的测定 |
| 2.2.6.4 金属离子对酶活力的影响 |
| 2.2.6.5 抑制剂与激活剂对酶活力的影响 |
| 2.2.7 组织蛋白酶B底物特异性的测定 |
| 2.2.8 Cathepsin B抗体的制备 |
| 2.2.8.1 免疫动物 |
| 2.2.8.2 抗体效价的检测 |
| 2.2.8.3 抗体的纯化 |
| 2.2.8.4 抗体的纯度鉴定 |
| 2.2.9 Cathepsin B抗体的应用 |
| 2.2.9.1 样品的前期处理 |
| 2.2.9.2 石蜡切片的制作 |
| 2.2.9.3 免疫组织化学技术 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 不同提取条件的选择 |
| 3.1.1 最适浸提缓冲液的确定 |
| 3.1.2 最适浸提时间的确定 |
| 3.1.3 最适硫酸铵饱和度的确定 |
| 3.2 组织蛋白酶B的分离纯化 |
| 3.2.1 DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换层析 |
| 3.2.2 Sephadex G-75凝胶层析 |
| 3.2.3 TSK-GEL 3000 SWx1凝胶层析 |
| 3.2.4 纯化结果分析 |
| 3.2.4.1 纯化结果 |
| 3.2.4.2 Native-PAGE对纯度的测定 |
| 3.2.4.3 SDS-PAGE对分子量的测定 |
| 3.3 酶学性质的研究 |
| 3.3.1 酶的最适pH值 |
| 3.3.2 酶的最适反应温度 |
| 3.3.3 酶的热稳定性 |
| 3.3.4 金属离子对酶活力的影响 |
| 3.3.5 抑制剂和激活剂对酶活力的影响 |
| 3.4 底物特异性的研究 |
| 3.5 抗体制备结果分析 |
| 3.5.1 ELISA结果分析 |
| 3.5.2 抗体纯化结果 |
| 3.5.2.1 亲和层析对抗体的纯化结果 |
| 3.5.2.2 SDS-PAGE对抗体纯度的检测 |
| 3.6 抗体应用的结果分析 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A |
| 附录B |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 海水无脊椎动物幼虫发育 |
| 1.2.1 幼虫发育的研究 |
| 1.2.2 贝类发育过程中的形态变化 |
| 1.2.3 贝类贝壳形成和生长 |
| 1.2.4 贝类幼虫生长摄食 |
| 1.2.5 幼虫变态机制的研究 |
| 1.3 贝类幼虫发育相关基因的研究 |
| 1.3.1 铁蛋白 |
| 1.3.2 组织蛋白酶家族 |
| 1.4 细胞凋亡在发育中的作用 |
| 1.4.1 细胞凋亡概念的形成 |
| 1.4.2 细胞凋亡的特点 |
| 1.4.3 caspase家族 |
| 1.4.4 细胞凋亡的信号转导途径 |
| 1.4.5 细胞凋亡的作用 |
| 1.4.6 caspase抑制剂 |
| 1.4.7 细胞凋亡的检测方法 |
| 第2章 文蛤铁蛋白基因的克隆和在幼虫生长发育中的表达分析 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 在不同铁离子浓度下培养幼虫的形态 |
| 2.2.2 cDNA克隆和序列分析 |
| 2.2.3 半定量PCR检测MmeFer在不同时期幼虫中的表达量 |
| 2.2.4 Real time PCR分析文蛤铁蛋白（MmeFer）m RNA在不同幼虫发育时期的表达 |
| 2.2.5 幼虫发育过程中MmeFer mRNA的空间表达 |
| 2.2.6 人工海水培养的幼虫中MmeFer mRNA 的空间表达 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 文蛤组织蛋白酶B的基因克隆和功能分析 |
| 第1节 文蛤组织蛋白酶B在幼虫营养中的作用 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 组织蛋白酶B酶基因的克隆和分析 |
| 3.2.2 MmeCB mRNA在文蛤各个发育时期幼虫中的时空表达 |
| 3.2.3 组织蛋白酶B特异性抑制剂对饥饿幼虫的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第2节 组织蛋白酶B在文蛤幼虫胚胎发育和变态中的功能分析 |
| 3.4 材料方法 |
| 3.4.1 实验材料 |
| 3.4.2 实验步骤 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 MmeCB mRNA在幼虫发育过程中表达量的变化 |
| 3.5.2 MmeCB在不同时期幼虫中的表达部位 |
| 3.5.3 CA074Me对文蛤幼虫变态的影响 |
| 3.5.4 CA074Me对文蛤胚胎发育的影响 |
| 3.6 讨论 |
| 第4章 细胞凋亡和caspase蛋白酶在文蛤幼虫发育中功能的初步分析 |
| 4.1 材料方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 文蛤幼虫发育过程中凋亡细胞的分布 |
| 4.2.2 caspase在不同发育时期幼虫中的分布 |
| 4.2.3 caspase的抑制剂对变态幼虫的影响 |
| 4.2.4 caspase基因cDNA片段 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表和完成的文章 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 导论 |
| 1 木本植物营养贮藏蛋白质研究进展 |
| 1.1 木本植物营养贮藏蛋白质的基本特征 |
| 1.2 木本植物营养贮藏蛋白质的生化特性 |
| 1.3 木本植物营养贮藏蛋白质的生理功能 |
| 1.4 营养贮藏蛋白质的积累与降解机理 |
| 1.5 木本植物营养贮藏蛋白质研究展望 |
| 2 蛋白质组学及其在农林业研究中的应用 |
| 2.1 蛋白质组学研究进展 |
| 2.2 蛋白质组学在林业研究中的应用 |
| 2.3 蛋白质组学在农业研究中的应用 |
| 2.4 林木蛋白质组学研究展望 |
| 3 立题依据、研究目的及意义 |
| 4 参考文献 |
| 第二章 银杏营养贮藏蛋白质的细胞学研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.2 采样方法 |
| 2.3 光镜样品的制作 |
| 2.4 电镜样品的制作 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 银杏的年生长周期 |
| 3.2 银杏显微结构分析 |
| 3.3 银杏超微结构分析 |
| 4 结论与讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 银杏营养贮藏蛋白质生物化学性质研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.2 采样方法 |
| 2.3 试剂 |
| 2.4 可溶性蛋白质干粉的制备 |
| 2.5 可溶性蛋白质含量的测定 |
| 2.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.7 双向凝胶电泳 |
| 2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的过碘酸-Schiff（PAS）试剂染色 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 银杏不同部位可溶性蛋白质含量的动态变化 |
| 3.2 银杏不同部位营养贮藏蛋白质的单向电泳分析 |
| 3.3 银杏营养贮藏蛋白质的双向电泳分析 |
| 3.4 银杏营养贮藏蛋白质的糖蛋白性质的分析 |
| 4 结论与讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 银杏营养贮藏蛋白质的免疫化学特性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.2 采样方法 |
| 2.3 试剂 |
| 2.4 银杏营养贮藏蛋白质抗血清的制备 |
| 2.5 银杏32kDa 和36kDa 两种蛋白质免疫印迹 |
| 2.6 酶标免疫光镜定位 |
| 2.7 胶体金免疫电镜定位 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 银杏营养贮藏蛋白质抗体制备的分析 |
| 3.2 银杏营养贮藏蛋白质的免疫印迹分析 |
| 3.3 银杏营养贮藏蛋白质免疫组织化学定位分析 |
| 4 结论与讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 总结论 |
| 1 主要研究结论 |
| 1.1 银杏营养贮藏蛋白质的细胞学研究 |
| 1.2 银杏营养贮藏蛋白质的生化性质的研究 |
| 1.3 银杏营养贮藏蛋白质的免疫组织化学定位研究 |
| 1.4 银杏营养贮藏蛋白质组分的确定 |
| 2 本研究的创新与特色 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 详细摘要 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 棉铃虫功能基因重组病毒杀虫剂研究 |
| 第一章 综述:昆虫杆状病毒研究进展 |
| 1 杆状病毒的类型存在形式、结构及感染宿主后的传播过程 |
| 2 杆状病毒表达系统的研究 |
| 3 重组杆状病毒生物杀虫剂 |
| 第二章 棉铃虫激素接受子3基因重组病毒杀虫剂研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验用品、仪器 |
| 2.1.2 昆虫和病毒 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组表达载体Bacmid-GFP-HHR3-Polh~+的构建 |
| 2.2.2 Bacmid-GFP-HHR3-Polh~+转染Sf21细胞 |
| 2.2.3 重组病毒感染体外培养的Sf21细胞 |
| 2.2.4 重组病毒在Sf21细胞中的外源基因表达检测 |
| 2.2.5 重组病毒AcMNPV-GFP-HHR3-Polh~+感染棉铃虫幼虫 |
| 2.2.6 重组病毒感染棉铃虫幼虫后外源基因的表达检测 |
| 2.2.7 重组病毒AcMNPV-GFP-HHR3-Polh~+杀虫生物活性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组表达载体构建和验证 |
| 3.2 重组病毒感染Sf21细胞后外源基因的重组表达 |
| 3.3 重组病毒感染棉铃虫幼虫后外源基因的重组表达 |
| 3.4 重组病毒杀虫效果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 棉铃虫组织蛋白酶B(HCB)基因重组病毒杀虫剂研究 |
| 前言 |
| 第一节 HCB在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的试表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组表达载体转染Sf21细胞 |
| 2.2 转染上清液感染Sf21细胞 |
| 2.3 Sf21细胞中的HCB基因的重组表达检测 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 重组表达载体的外源基因插入位置 |
| 3.2 PCR鉴定重组病毒基因组中的HCB目的基因 |
| 3.3 SDS-PAGE检测HCB的表达 |
| 3.4 免疫印迹结果 |
| 3.5 蛋白酶活性检测 |
| 第二节 棉铃虫组织蛋白酶B基因重组病毒杀虫剂研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组表达载体Bacmid-GFP-HCB-Polh~+的构建 |
| 2.2 Bacmid-GFP-HCB-Polh~+转染Sf21细胞、转染液感染Sf21细胞 |
| 2.3 重组病毒感染的Sf21细胞中外源基因的表达检测 |
| 2.4 重组病毒AcMNPV-HCB-GFP-Polh~+感染棉铃虫幼虫 |
| 2.5 重组病毒感染棉铃虫幼虫后外源基因的表达检测 |
| 2.6 重组病毒杀虫生物活性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组表达载体构建结果和验证 |
| 3.2 Sf21感染细胞内GFP和polyhedrin的重组表达 |
| 3.3 Sf21感染细胞内HCB的表达 |
| 3.4 重组病毒感染棉铃虫幼虫外源基因的表达 |
| 3.5 重组病毒杀虫效果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 棉铃虫表皮、精巢、卵巢细胞系建立 |
| 第一章 综述:昆虫细胞培养研究进展 |
| 1 体外培养、细胞系的概念及细胞系的鉴定 |
| 2 昆虫细胞培养基的发展和国内外建立昆虫细胞系的情况 |
| 3 昆虫细胞系的应用 |
| 4 棉铃虫细胞系的建立及研究意义 |
| 第二章 棉铃虫表皮细胞系的建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 棉铃虫表皮细胞原代培养 |
| 2.2 传代培养 |
| 2.3 细胞的冻存 |
| 2.4 细胞的复苏 |
| 2.5 细胞生长曲线和群体倍增时间的测定 |
| 2.6 染色体分析 |
| 2.7 病毒敏感性检测 |
| 2.8 同工酶检测 |
| 2.9 细胞克隆化培养 |
| 3 结果 |
| 3.1 棉铃虫表皮细胞系SDU-Ha-Epi的形成 |
| 3.2 细胞的保存、复苏 |
| 3.3 细胞生长规律和群体倍增时间 |
| 3.4 染色体分析 |
| 3.5 病毒敏感性 |
| 3.6 同工酶检测结果 |
| 3.7 细胞克隆化培养 |
| 4 讨论 |
| 第三章 棉铃虫精巢及卵巢细胞系建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 原代培养方法 |
| 2.2 传代培养 |
| 2.3 细胞冻存和复苏 |
| 2.4 精巢细胞系细胞生长曲线和群体倍增时间的测定 |
| 2.5 精巢细胞系染色体分析 |
| 2.6 精巢细胞系病毒敏感性检测 |
| 2.7 精巢细胞系细胞克隆化培养 |
| 3 结果 |
| 3.1 棉铃虫精巢细胞系SDU-Ha-Spe的形成 |
| 3.2 精巢细胞系细胞的保存、复苏 |
| 3.3 精巢细胞系细胞生长规律和群体倍增时间 |
| 3.4 精巢细胞系染色体分析 |
| 3.5 精巢细胞系病毒敏感性 |
| 3.6 精巢细胞系细胞克隆化培养 |
| 3.7 棉铃虫卵巢细胞系SDU-Ha-Ova的建立 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 已发表和拟发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
