郭恰恰[1]（2021）在《氨基修饰脱氧核苷酸用于长片段PCR研究》文中提出DNA聚合酶链式反应（PCR）自诞生以来以其操作简便、灵敏性强的特点迅速引起关注。其在基因工程、基因诊断以及疾病检测方面发挥着重要作用。PCR技术一个发展方向是对长片段DNA的扩增。长片段PCR以其扩增片段长为特点,但是目前的扩增长度无法完整扩增生物体内的基因。长片段PCR反应持续时间更长,因此对反应底物的热稳定要求更高。目前,几种商业性的DNA聚合酶已满足热稳定性要求,但是反应中dNTP的热稳定性一直被忽略,因此开发新型热稳定dNTP类似物有重要研究意义。研究发现dNTP末端磷酸上的两个羟基是其不稳定的主要原因,考虑到末端磷酸基团远离DNA聚合酶的催化中心,对酶反应活性影响较小,本文设计合成多个dNTP末端磷酸修饰物,以期在增强其热稳定性的同时使其可以被DNA聚合酶识别利用,用于长片段PCR扩增。本文主要研究内容如下:1)综合考虑化合物的热稳定性和对DNA聚合酶反应速率的影响,本文将dNTP末端磷酸上的一个羟基替换为氨基,合成磷酰胺类化合物。我们尝试了多种合成方法,成功合成dATP-NH2、dTTP-NH2、dCTP-NH2、dGTP-NH2四个目标化合物,并找到了产率相对较高的合成路径,产率为40%-60%。2)我们通过模拟PCR环境,验证了其热稳定性。75℃恒温孵育48 h后,dATP-NH2剩余69%,而dATP仅有15%剩余,表明其热稳定性较天然dNTP有大幅度提升。在研究热稳定性的同时分析二者水解产物,发现水解化合物皆为dADP和dAMP,且在整个实验过程中dADP所占比例都比dAMP高,表明dNTP水解是从末端磷酸开始,逐个脱落磷酸基团。3)以dNTP-NH2为原料,利用不同的DNA聚合酶进行扩增,均得到目标扩增产物。证明合成的化合物可以被多种DNA聚合酶识别利用;利用合成的化合物探究PCR延伸时间对目的基因扩增量影响,证实随着延伸时间增长,目的基因扩增量增加,表明以dNTP-NH2为底物,可以通过增长延伸时间弥补酶反应效率略低的问题。4)用dNTP-NH2为底物进行PCR反应,成功扩增出1 kb、3 kb和6kb和10 kb片段,说明dNTP-NH2不仅可以用于常规PCR,还可以用于长片段PCR反应。在长片段扩增（6kb）中利用不同DNA聚合酶均成功扩增出目的基因,表明dNTP-NH2在长片段扩增中应用前景较广。综上,本文合成的dNTP-NH2,热稳定性明显提升,可以被多种DNA聚合酶识别且在PCR扩增中表现良好,表明dNTP-NH2在长片段扩增中具有广泛的应用前景。
王一航[2]（2021）在《拮抗法医检材四种抑制剂的研究》文中提出[目 的]目前,进口 DNA商品化试剂盒普遍被用于法庭科学检案中,然而,各试剂盒由于其聚合酶链式反应（PCR）缓冲液组分和浓度不同,导致其抗抑制能力各不相同。通过检测国内外十一个扩增试剂缓冲液中小牛血清蛋白（BSA）的浓度,发现BSA浓度与其试剂盒抗抑制能力的相关性;通过在公安部物证鉴定中心研发的DNATyperTM21国产扩增试剂缓冲体系中添加不同浓度的黑色素、血红素、腐殖酸和靛蓝等四种抑制剂,抗抑制物BSA和额外的Taq DNA聚合酶,获取DNATyperTM 21扩增试剂对不同抑制剂的耐受浓度,适宜的BSA和Taq DNA聚合酶浓度。针对中国案件检材特点,为国产DNA检案试剂盒赶超国外同类产品提供实验数据支撑。[方 法]1、用考马斯亮蓝染色方法检测AB等十一种扩增缓冲液中的BSA浓度;2、配制不同浓度的黑色素、血红素、腐殖酸、靛蓝等四种PCR抑制剂,添加到TyperTM 21扩增体系中,进行PCR扩增、毛细管电泳、统计不同浓度下各基因座的检出率,获得该扩增试剂盒的对上述四种抑制剂的检测阈值;3、添加不同浓度的BSA、Taq DNA聚合酶和不同浓度梯度的黑色素、血红素、腐殖酸、靛蓝等抑制剂到TyperTM 21扩增体系中,获得该扩增试剂添加抗抑制物BSA和酶后对上述四种抑制剂的检测阈值。[结 果]1、国内外不同扩增试剂缓冲液中BSA的浓度差异较大,其中,Promega 公司的 PowerPlex（?）21 试剂盒的 BSA浓度最高达 132.85ng/μL,TyperTM 21扩增试剂盒中的BSA浓度最低,仅为3.46ng/μL,其余介于二者之间;2、当腐殖酸、血红素、黑色素、靛蓝在TyperTM 21扩增体系中的浓度分别为25ng/μL、100μM、15ng/μL、2mM时,能获得全部基因座条带,而随着抑制剂浓度增加,从大片段到小片段基因座出现丢带的现象;3、在TyperTM 21扩增体系中加入2000ng/μL的BSA时,其对腐殖酸、血红素、黑色素、靛蓝的耐受性分别提高到150ng/μL、750mM、60ng/μL和12mM。在含有血红素、腐殖酸的TyperTM 21扩增体系中加入Taq DNA聚合酶,抗抑制效果显着提高,但出现非特异性扩增带;加入BSA后抗抑制效果也提高,但高浓度BSA会导致部分基因座出现双尖峰。Taq DNA聚合酶和BSA同时加入含有血红素、腐殖酸的扩增体系,可避免非特异条带及双尖峰的出现。[结 论]国内外不同扩增试剂缓冲液中BSA的浓度差异较大,其中TyperTM21扩增缓冲液中的浓度最低,可能是该试剂盒对腐殖酸、血红素、黑色素、靛蓝等四种抑制剂耐受值较低的原因;当添加2000ng/μL的BSA及额外的Taq DNA聚合酶后,其抗抑制性能显着提高。BSA是重要的抗抑制物。
秦盼柱[3]（2021）在《基于核酸扩增原理的常见肉源性成分快速鉴定研究》文中研究说明肉类食品是人类饮食的重要组成部分,肉制品安全与人们的身体健康和生命安全直接相关。近年来接连发生的肉制品安全事件使人们充分意识到建立准确、有效的肉品质量监管机制的重要性。然而,目前的检测方法仍以实验室分析为主,可用于快速、简单和现场检测肉源性成分的方法较少。针对肉制品检测的研究现状,本论文以聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）等核酸扩增技术为基础,并与荧光分析、荧光偏振（FP）、侧向层析试纸（LFS）和表面增强拉曼光谱（SERS）等流行的传感技术相结合,旨在建立简单、快速和灵敏的常见肉源性成分检测新方法。主要内容如下:（1）基于功能化引物设计的PCR方法检测牛肉中的马肉成分。PCR引物的末端被设计成了独特的颈环结构,颈环结构上标记了荧光基团和淬灭基团。在初始条件下,颈环上的荧光基团和淬灭基团相互靠近,荧光信号很弱。当马肉成分存在时,功能化的引物会参与扩增过程,导致引物末端的颈环结构被打开并产生荧光信号的恢复。且马肉成分越多,收集的荧光信号越强。在最优条件下,该方法对牛肉中掺假马肉的检测限为0.04%（w/w）。此外,对加工牛肉样品的检测进一步证实了该方法的实际应用潜力。与传统PCR相比,该方法在检测效率上具有明显的优势,并充分突出了其快速检测和易于操作的特点。（2）基于单链结合蛋白增强的荧光偏振策略检测牛肉中的鸡肉成分。将传统PCR技术与FP技术相结合,提出了一种基于单链结合蛋白（SSB）增强的FP策略,可用于灵敏检测肉品中的鸡肉成分。基因组模板提取后,首先使用荧光基团标记的针对鸡肉特异的引物进行PCR扩增。然后在扩增产物中加入SSB,使单链引物与SSB充分结合。当没有鸡肉成分时,荧光基团标记的引物可以与后续添加的SSB牢固结合,荧光基团的运动被束缚,因此FP信号很高。当存在鸡肉成分时,荧光基团标记的引物在扩增过程中被消耗,不能与后续添加的SSB结合,导致FP信号降低。而且,鸡肉成分越多,测量的FP信号越低,进而建立起鸡肉掺假比例与FP信号的相关关系。在最优条件下,该方法对牛肉中掺假鸡肉的检测限为0.035%（w/w）。该方法强调了FP技术在PCR产物快速分析中的应用,突出了SSB对FP信号的增强作用。与基于电泳分析和荧光回收的传统检测方法相比,该方法具有设计简单、操作方便和检测快速的优点。（3）基于环介导等温扩增的荧光偏振方法快速检测牛肉中的猪肉成分。通过巧妙地将荧光基团标记的引物应用于LAMP的反应系统,构建了一种结合了LAMP技术的等温扩增优势和FP技术的快速检测优势的理想平台。荧光基团标记的引物分子量较小且旋转速率较快,因此显示的FP信号有限。当存在猪肉成分时,分子量较小的引物经过扩增被转变成大分子量的产物,导致荧光基团的旋转受到限制,因此FP信号显着增强。在最优条件下,该方法可以检测到牛肉中低至0.01%（w/w）的掺假猪肉。与需要复杂分析过程的传统检测方法相比,该策略具有简单、灵敏、快速和现场检测的优点。重要的是,这种独特的方法也适用于加工肉产品的检测。我们期望本研究能为食品安全检测方法的建立提供新的视角。（4）基于多重PCR的侧向层析试纸方法同时检测鸡肉、鸭肉和猪肉成分。把多重PCR和LFS技术相结合,开发了一种同时检测肉品中多种肉类成分的可视化方法。针对鸡肉、猪肉和鸭肉的三组引物末端分别连接了不同的核酸标签,因此获得的扩增产物两端也具有不同的核酸标签。使用LFS分析扩增产物时,扩增产物的一端可以与金纳米粒子（Au NPs）上的识别探针杂交,另一端可以与对应检测线上的捕获探针杂交,从而把Au NPs固定到对应的检测线上并使之变红。重要的是,每种掺假成分分别对应一条检测线,因此可以通过一次反应实现对三种掺假成分的同时和可视化检测。得益于PCR技术的高效率和LFS技术的简便性,该方法对鸡肉、鸭肉和猪肉的检测限分别为0.006%（w/w）、0.004%（w/w）和0.007%（w/w）。（5）基于重组酶聚合酶扩增的侧向层析试纸方法同时检测鸭肉、鸡肉和猪肉成分。把RPA技术与LFS技术相结合,建立了一种同时检测肉品中鸭肉、鸡肉和猪肉成分的可视化方法。在RPA的扩增体系中,我们引入了三组分别针对鸭肉、鸡肉和猪肉特异的末端功能化的引物,因此可以实现对三种目标基因的同时扩增。当掺假成分存在时,通过扩增可以获得两端标记的双链产物,借助双链产物的桥接作用即可把Au NPs固定到对应的检测线上并使之变红。该方法重点突出了RPA技术的等温扩增和多重放大优势,强调了RPA技术与LFS技术的联合使用在肉类掺假检测中的应用潜力。在最优条件下,该方法对鸡肉、鸭肉和猪肉的检测限分别为0.009%（w/w）、0.005%（w/w）和0.004%（w/w）。（6）基于表面增强拉曼光谱的侧向层析试纸方法同时检测牛肉中的多种肉类成分。以RPA的扩增产物为媒介,将SERS技术和LFS技术相结合,提出了一种检测肉品中多种肉类成分的新方法。为简化LFS的设计,采用三种拉曼信标作为三种肉类的标记物,只使用一条检测线同时捕获三种扩增产物。当检测线显色时即可证明样品中有目标成分存在,然后利用拉曼光谱分析肉品的具体成分。该方法是在（5）中研究的基础上发展出来的,重点强调了RPA技术、LFS技术和SERS技术在肉类成分检测中的联合应用。在最优条件下,该方法对鸡肉、鸭肉和猪肉的检测限分别为0.006%（w/w）、0.005%（w/w）和0.009%（w/w）。
宋超逸[4]（2021）在《开发新型基因编辑技术用于多杀菌素异源表达和结构衍生》文中认为多杀菌素（spinosad）是土壤放线菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）发酵产生的聚酮化合物,对鳞翅目、缨翅目等害虫具有高效杀虫活性,而对哺乳动物、鱼类、鸟类和非靶标昆虫毒性极低,由于其兼具生物农药的安全性和化学农药的速效性,已被美国陶氏益农公司（Dow Agrosciences）开发为生物农药,广泛应用于农业、园林和粮储害虫的防控,并于1999年获得了美国总统绿色化学挑战奖。除了多杀菌素的主要活性成分多杀菌素A/D（spinosyn A/D）,刺糖多孢菌发酵产生一系列多杀菌素类化合物,为了获得活性更好的衍生物,人们对3’-氧-脱甲基-多杀菌素A（spinosyn J）和3’-氧-脱甲基-多杀菌素D（spinosyn L）进行化学修饰获得了3’-氧-乙基-5,6-二氢-多杀菌素J（5,6-dihydro-3’-O-ethyl-spinosyn J）和3’-氧-乙基-多杀菌素L（3’-O-ethyl-spinosyn L）,其混合物被称为乙基多杀菌素（spinetoram）。乙基多杀菌素不仅保持了良好的环境兼容性和低哺乳动物毒性,且具有更高的杀虫活性、更广的杀虫谱及良好的水溶性和光稳定性,对多杀菌素难以防控的苹果蠹蛾和烟草夜蛾幼虫具有良好的杀灭效果。丁烯基多杀菌素（butenyl-spinosyn）原产于须糖多孢菌（Saccharopolyspora pogona）,主要活性成分为丁烯基多杀菌素A/D（butenyl-spinosynA/D）,是自然进化产生的多杀菌素高活性衍生物,其C-21上连接的是丁烯基而多杀菌素是乙基,其杀虫活性和杀虫谱与乙基多杀菌素类似,但尚未有应用的报道。我国多杀菌素产业正处于发展初始阶段,急需建立具有自主知识产权的高产技术。多杀菌素作为典型的聚酮化合物,分子结构复杂,化学合成困难,因此,基于微生物发酵的生物合成倍受青睐,然而多杀菌素原产菌株培养条件复杂,生长缓慢,且遗传操作困难,导致针对刺糖多孢菌的基因工程育种进展缓慢。因此,克隆多杀菌素生物合成途径并在易于遗传操纵的细菌中进行异源表达的策略,已成为多杀菌素高效生物制造的重要研究方向。多杀菌素基因簇长达74 kb,由5个聚酮合酶基因和18个后修饰基因组成,对如此复杂的基因簇进行克隆和改造非常有挑战性,需要进行基因编辑技术创新。基因编辑技术的发展为天然产物生物合成途径的克隆、组装与改造提供了便利,促进了天然产物合成生物学的发展,然而现有的基因编辑技术仍存在诸多局限。DNA多片段组装技术已成为重构天然产物基因簇的有效方法,然而,放线菌来源的聚酮基因簇GC含量通常高于65%且含有众多重复序列,现有Gibson和SLIC等体外组装方法以及TAR介导的体内组装方法对高GC片段和启动子片段的兼容性较差,可组装片段数量有限,无法满足大型基因簇表达载体构建及系统改造的需求。本研究利用直接克隆、DNA多片段组装和线环同源重组等基因编辑技术,成功从刺糖多孢菌染色体上抓取了完整的多杀菌素基因簇,构建了大肠杆菌-链霉菌穿梭载体,成功实现了多杀菌素在白色链霉菌J1074（Streptomycesa/bus J1074）、变铅青链霉菌 K4-114（Streptomyces lividans K4-114）和天蓝色链霉菌CH999（Streptomyces coelicolor CH999）中的异源表达。为了提高多杀菌素的产量,我们在多杀菌素基因簇中第一个聚酮合酶基因的上游插入组成型强启动子ErmE*p,使多杀菌素产量提高了2.1倍,这说明提高生物合成基因的转录水平可以促进多杀菌素的异源生物合成。要实现所有23个生物合成基因的高效表达,需要高效的DNA组装技术对基因簇进行重构。经过测试,本研究发现,ExoCET技术利用核酸外切酶介导的体外同源重组和RecET蛋白介导的细胞内同源重组,能够高效组装>13个高GC含量的DNA片段。于是,我们将多杀菌素生物合成涉及的23个基因按照功能分为5组,且每组基因均由色链霉菌J1074来源的组成型强启动子驱动,最终利用ExoCET多片段组装技术构建了由5个操纵子组成的人工基因簇。该多操纵子人工基因簇在白色链霉菌J1074中的摇瓶发酵产量达到了1.12mg/L,比原始基因簇提高了328倍。我们发现,ExoCET技术具有高效DNA组装效率的原因是,该技术中核酸外切酶介导的体外同源重组能将多片段部分串联起来,提高它们共同进入同一大肠杆菌细胞的几率;细胞内表达的RecET重组酶能将未环化的线状DNA片段通过末端同源臂进一步发生同源重组,最终形成环状重组质粒。我们比较了ExoCET多片段组装技术与商业化的Gibson试剂盒对GC含量大于65%的高GC含量DNA片段的组装能力,ExoCET技术对7个以下片段的组装正确率为100%,13片段的组装正确率也可达到60%,而Gibson技术仅能实现5个以下片段的高效组装,当片段数量大于5时,组装效率急剧下降,7片段组装效率已下降到30%,且不能实现7片段以上的高GC DNA组装,以上结果表明我们的ExoCET技术在高GC含量DNA片段的组装方面具有很好的优势。提高天然产物生物合成限速步骤相关基因的表达水平是提高天然产物产量的有效途径,本研究提出的多操纵子基因簇策略针对跨种属表达调控元件差异导致的异源基因表达水平低下,遵循宿主组成型强启动子过表达的思路,借助ExoCET多片段组装的技术优势,使所有生物合成基因均处于组成型强启动子的控制下,实现天然产物所有生物合成基因的高效表达,从而大幅提高目标化合物产量。上述成果于2019年以共第一作者（1/2）发表在 ACS Synthetic Biology。在以上工作基础上,我们计划对多杀菌素人工基因簇进行改造,以实现高活性衍生物丁烯基多杀菌素和3’-氧-脱甲基-多杀菌素的异源表达。然而,依赖于PCR的Agilent QuikChange或Takara MutanBest等商业化定点突变试剂盒受限于PCR有效扩增长度和模板GC含量,无法用于大型高GC生物合成基因簇的定点突变;生物信息学分析表明,多杀菌素基因簇中存在所有49种商业化lls核酸外切酶的识别位点,因此,依赖于lls型限制性内切酶偏移剪切的Golden Gate技术也无法用于该基因簇的无缝编辑;同时,在多杀菌素基因簇中,功能相同的结构域高度同源导致PKS基因中形成了68对长度大于35 bp的同向重复序列,Red 重组系统可以介导同向重复序列间的高效重组,而反向筛选却无法排除这些非特异性重组背景,导致基于Red重组系统和ccdB反向筛选的无缝定点改造技术无法直接操纵PKS基因;因此,为了改造人工多杀菌素基因簇,我们需要创新基因编辑技术。本研究开发了不受聚酮合酶基因中重复序列限制的RedEx基因编辑技术,该技术整合了Red重组系统介导的线环重组、ccdB反向筛选和核酸外切酶（Exonuclease）介导的体外退火,合理利用同源重组的灵活性和体外退火对DNA分子内部重复序列的高度兼容性,可以对大型复杂天然产物基因簇中任意位点进行精确的无缝插入、删除,替换和点突变等修饰。利用RedEx技术,我们将须糖多孢菌丁烯基多杀菌素基因簇busA基因的1b模块无缝定点插入到spnA基因中,重组基因簇在白色链霉菌中成功合成了多杀菌素高活性衍生物——丁烯基多杀菌素;通过无缝删除人工多杀菌素基因簇中编码3’-O-甲基化转移酶的spnK基因,使重组基因簇在白色链霉菌中成功合成了乙基多杀菌素化学合成原料——3’-氧-脱甲基-多杀菌素。聚酮化合物模块化、共线性的生物合成机制使其具有巨大的重编程潜力,生物合成途径的重编程已成为定向改造聚酮化合物结构的有效途径,然而,模块化的生物合成机制也导致了聚酮生物合成基因簇DNA序列的复杂性,模块间功能相同结构域高度同源,聚酮合酶基因重复序列密集,RedEx在改造此类基因簇上的巨大优势为天然产物合成生物学研究提供了新方法。上述成果于2020年以共同第一作者（1/2）发表在Nucleic Acids Research。综上所述,本研究通过开发ExoCET多片段组装技术,设计并构建了人工多杀菌素基因簇,实现了多杀菌素的高效异源表达,大幅提高了多杀菌素在链霉菌中的异源表达产量。通过开发RedEx无缝定点改造技术,定向改造多杀菌素化学结构,实现了高活性衍生物丁烯基多杀菌素和3’-氧-脱甲基-多杀菌素的异源表达。该研究构建的多杀菌素及其衍生物的高效异源表达菌株为诱变育种等传统育种方法提供优良的初始菌株,也为应用合成生物学策略开发多杀菌素衍生物,实现多杀菌素及其高活性衍生物的高效生物制造奠定了基础。ExoCET多片段组装技术和RedEx无缝定点改造技术丰富了合成生物学工具箱,为天然产物生物合成途径的构建和系统改造提供了新方法和新思路。
沈皖珠[5]（2021）在《DNA合成错误纠正及相关检测新技术研究》文中认为DNA从头合成技术是以化学合成寡核苷酸链为起始制备长片段DNA技术。凭借设计灵活、不受天然模板限制、可规模化生产等显着优势,DNA从头合成迅速发展成为合成生物学的底层支撑技术。目前基因片段的人工合成及组装中存在的一个重大问题是DNA产物保真度较差,在寡核苷酸的化学合成、短片段组装及拼接过程中都会引入碱基错误,导致获得正确产物的筛选难度增大、测序成本增加,严重影响合成效率。基于错配切割法和错配结合法的DNA合成错误纠正技术可有效降低合成序列的错误率,减少重复克隆筛选工作量、时间和成本。但现有DNA合成错误纠正技术因试剂昂贵、单种纠错酶纠错效果不稳定、操作复杂等问题,并没有大规模应用于DNA合成中。在本研究中,我们提出了一种基于多种错配切割酶协同作用的组合酶纠错体系,利用多种酶之间不同的作用机制来开发纠错效果稳定、适合不同目标序列且成本较低的酶法纠错新技术。同时,对基于错配结合酶Mut S蛋白的物理分离纠错法进行了验证,利用Mut S蛋白固定化的Fe3O4颗粒作为错配双链捕获工具,简化纠错后DNA溶液回收操作,使DNA合成错误纠正法可以向着自动化方向发展。最后,基于磁性纳米标签材料开发了新型的表面增强拉曼光谱（Surface enhanced Raman spectroscopy,SERS）免疫层析检测新技术,用于DNA错配序列及肿瘤标志物的高灵敏检测。论文的主要研究内容如下:（1）一种新型的组合酶纠错体系的开发及优化筛选十种常用错配切割酶,比较各酶纠错特性如正确克隆提高比例、错误率降低幅度,选择纠错效果最佳的错配切割酶组合。试验不同组合酶（种类、数量等）纠正1.2千碱基对（kb）和3.7kb序列效果。优化组合酶纠错反应条件,包括反应时间、反应温度、反应缓冲液、酶用量、纠错次数。对组合酶纠正2.1kb和2.5kb序列进行性能验证。经过筛选和优化,建立了组合酶错配切割纠错法,合成的DNA序列正确率比T7核酸内切酶I纠错后正确率提高1～2倍,二轮纠错效率与商业化纠错试剂Surveyor相当,对部分序列纠错效果甚至超过Surveyor。（2）基于Mut S蛋白固定化磁珠的纠错能力评价采用碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）化学偶联法将三种Mut S蛋白分别修饰在羧基化磁珠上,试验磁珠@Mut S特异性结合固定错配双链和非特异性结合同源双链能力,并筛选出纠错活性最强的Taq Mut S蛋白。设计两种磁珠@Mut S纠错策略,一是试验磁珠@Mut S单独纠正1.2kb序列效果,二是试验核酸内切酶V与磁珠@Mut S联合纠正1.2kb序列效果。实验结果表明核酸内切酶V与磁珠@Mut S联合纠正1.2kb DNA序列可将错误率从2.35/kb降至1.64/kb。磁珠@Mut S与核酸内切酶V联合纠错法可有效降低序列错误率,为DNA人工合成中的错误纠正提供了新的研究方法与思路。（3）发明一种磁性SERS层析法用于DNA错配序列及肿瘤标志物的检测首先采用具有SERS活性及磁富集能力的金壳磁性纳米材料（Fe3O4@Au）作为检测标签,在其表面修饰Taq Mut S蛋白用于溶液中DNA错配序列的捕获。通过在免疫层析试纸条上构建检测线（T线）的方式,捕获形成的Fe3O4@Au-Mut S-DNA错配序列,并通过检测T线产生的SERS信号实现对错配序列的快速检测。此外,为了进一步提升磁性SERS层析的灵敏度,发明了一种树莓状的Fe3O4@Au作为新型SERS标签,具有精密的表面缝隙和极强的SERS性能。最后利用基于树莓状Fe3O4@Au标签构建用于肿瘤标志物联合检测的磁性SERS免疫层析体系,实现了三种常见肿瘤标志物的高灵敏定量检测。
张雪松[6]（2020）在《古菌DNA聚合酶D及复制相关蛋白的表达纯化与功能初步研究》文中研究指明古菌资源是理论和应用研究的热点之一。古菌中,在DNA聚合酶和相关蛋白协同作用下保证遗传信息的准确传递,这对于生命的延续有着极其重要的作用。研究和开发这些蛋白不仅有理论价值,而且有潜在的市场前景。DNA聚合酶D（DNA polymerase D,Pol D）在古菌中以亲本链为模板不断合成新链,是DNA复制的重要参与者。而Endo Q,Endo MS,UNG等复制相关蛋白则负责消除复制产生的各类错误碱基,保证DNA复制的准确性。Pol D及DNA复制准确性相关蛋白Endo Q,Endo MS,UNG有望应用于提高聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的灵敏度与保真度方面,进一步提升基因片段克隆的效率。本文围绕这些蛋白开展了以下几项研究工作:（1）以E.coli为宿主异源表达来自嗜热古菌（Thermococcus sp.4557）的Pol D,Endo MS,Endo Q和来自鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）的UNG;利用Ni-NTA亲和层析、阴离子交换层析、疏水层析等手段,纯化Pol D聚合酶的两个亚基蛋白DP1及DP2;利用“Ni-NTA亲和层析+疏水层析”方法纯化出Endo Q,Endo MS和UNG蛋白。最终得到DP1蛋白22.5 m L（1.49 mg/m L）,DP2蛋白11 m L（0.56 mg/m L）,Endo Q蛋白12.5 m L（1.31 mg/m L）,Endo MS蛋白10 m L（0.92 mg/m L）,UNG蛋白6.4 m L（1.62 mg/m L）,为后续实验提供材料。（2）用荧光标记DNA探针结合PAGE电泳实验研究Pol D聚合酶两个亚基的功能。结果表明,大亚基DP2具有体外DNA延伸活性,小亚基DP1具有3’?5’核酸外切酶活性。DP2的体系内用量为0.1pmol时仍然可以完成延伸;延伸体系内,若DP1过多则DNA会被完全降解。DP2的存在会明显促进DP1的外切酶活性。复制因子GINS51对DP1的外切酶活性有抑制作用。以上结果补充了Pol D在古菌DNA复制过程中的相关信息。（3）在普通Taq酶催化的PCR反应体系中应用纯化的DNA复制修复因子Endo MS,Endo Q,UNG等蛋白,通过测序PCR扩增产物,统计扩增产物的突变率。结果表明,Endo Q,Endo MS,UNG的介入分别使PCR扩增的产物的整体突变率降低至原来的95.6%,95.3%,90.1%,即提高了PCR反应的保真度。而这些蛋白也可能在高保真DNA聚合酶扩增系统中发挥相似作用。这一新设计有望成为降低高保真度PCR扩增成本的可选途径。综上,本文工作丰富了对Pol D的亚基DP1和DP2,Endo Q,Endo MS,UNG等蛋白的认识,可为提高PCR反应的灵敏度和保真度提供参考。
聂福平[7]（2020）在《牛结节性皮肤病检测新方法与ORF132基因表达及鉴定研究》文中认为牛结节性皮肤病（Lumpy skin disease,LSD）又称牛结节性皮炎或块状皮肤病或牛疙瘩皮肤病,是由羊痘病毒属（Capripoxvirus）的牛结节性皮肤病病毒（Lumpy skin disease virus,LSDV）引起牛的一种急性、亚急性接触性传染病。各种品种和年龄的牛均易感,发病率在2%～45%,死亡率达10%,甚至更高,给经济带来较大的损失。该病被世界动物卫生组织（OIE）列为必须通报的传染病,《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》I类传染病,因此,在该病流行的国家和地区,其易感动物及动物源性产品出口将受到世界各贸易国的严格限制,极大的影响畜牧业和国际贸易的发展。针对该病主要采用疫苗防治,尚无药物可治疗,且该病原现有的检测方法单一或不能较好的鉴别检测。本研究基于LSDV的ORF001、ORF101和ORF126基因,建立了羊痘病毒属病毒的LAMP检测方法,牛结节性皮肤病病毒通用型Taq Man MGB实时荧光定量PCR方法和牛结节性皮肤病病毒野毒株与疫苗株双重Taq Man MGB实时荧光定量PCR方法,并应用建立的方法,对重庆、新疆、黑龙江、云南等地区的牛、羊进行羊痘病毒流行病学调查研究,试验从LSDV核酸阳性的媒介生物中成功分离出1株牛结节性皮肤病病毒。研究针对LSDV ORF005和ORF132蛋白分别构建了真核表达载体和重组穿梭载体,以Cellfectin Reagent介导下,转染Sf9昆虫细胞,并在Sf9昆虫细胞中获得成功表达,为牛结节性皮肤病血清学方法的建立和疫苗研究奠定了基础。（1）建立了CaPV-LAMP检测方法,可特异、敏感的检测羊痘病毒属病毒。该方法对LSDV的最低检出限为14.7TCID50,比常规PCR高100倍,比荧光定量PCR法略低,CaPV-LAMP检测方法具有良好的稳定性和重复性,其可视法不需要特殊仪器,可肉眼直接判读结果,适用于临床上CaPV的现场快速筛查。（2）建立了牛结节性皮肤病病毒通用型Taq Man MGB实时荧光定量PCR方法,方法最低检出量为21.6拷贝/μL,可特异、敏感的鉴别检测羊痘病毒属病毒,重复性较好,扩增效率为95.3%。在临床样本中,最低可检出3.8 pg/m L的病毒DNA。研发的试剂盒稳定性好,储存于4℃可保存6个月,-20℃至少可保存14个月。应用于临床样本的检测,显示该方法可特异地检测牛羊血液、皮肤、淋巴结等样品中的LSDV核酸,适用于牛结节性皮肤病的诊断和流行病学调查。（3）建立了牛结节性皮肤病病毒野毒株与疫苗株的双重Taq Man MGB实时荧光定量PCR方法,可特异、敏感地鉴别LSDV野毒株与疫苗株,对山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛痘病毒、羊口疮病毒等均无特异扩增,方法对野毒株和疫苗株病毒核酸的最低检出量分别为22.6拷贝/μL和19.7拷贝/μL,扩增效率为99.5%,并研发了相应的标准化诊断试剂盒。对试验感染LSDV野毒株的牛EDTA抗凝血进行检测,最低检出限为9 DPI。方法特异、敏感、简便、快速,可为牛结节性皮肤病的疫情监测和弱毒疫苗免疫监控提供鉴别技术手段。（4）针对LSDV的ORF005和ORF132基因进行系统分析,密码子优化,设计引物,扩增目的基因,将目的基因回收、连接到p Fast Bac-HTB载体上,转化,构建真核表达载体p Fast Bac-HTB-ORF005和p Fast Bac-HTB-ORF132。分别将重组质粒p Fast Bac-HTB-ORF005、p Fast Bac-HTB-ORF132转入E.coli DH10Bac感受态细胞,构建重组穿梭质粒r Bacmid-ORF005和r Bacmid-ORF132,以Cellfectin Reagent介导,在Sf9昆虫细胞中进行了真核表达。经Western blot分析和IFA鉴定,ORF005和ORF132蛋白在Sf9昆虫细胞中均获得成功表达,为新型疫苗的研制和抗体诊断方法的建立奠定了基础。（5）应用本研究建立的实时荧光定量PCR方法、CaPV-LAMP方法及OIE推荐的常规PCR方法,分别对新疆、云南、黑龙江、重庆等地区牛、羊的羊痘病毒属病毒流行情况进行调查研究。从新疆伊犁边境地区牛结节性皮肤病病毒核酸检测阳性的媒介生物中进行病毒分离,接种MDBK细胞,盲传3代后,成功分离出1株牛结节性皮肤病病毒,命名为XJ1917株,经测序分析,本次分离的牛结节性皮肤病病毒与LSDV Neethling疫苗株同源性为99%,并在ORF126区域存在27个碱基缺少,3个位点的突变。经TCID50测定,XJ1917株第5代细胞病毒液的滴度为3.65×106TCID50/mL。
黄丽芳[8]（2020）在《热启动DNA聚合酶的制备及其在食品检测中的初步应用》文中提出直接PCR技术具有省时、省力的优势,在食品快速检测领域具有广泛的应用前景。目前,直接PCR技术还存在着检测灵敏度不足,扩增成功率不高等问题,不能完全满足检测需求。DNA聚合酶为直接PCR反应体系中的核心组分,改造DNA聚合酶从而提高其耐抑制剂性能、扩增速度及灵敏度对推动直接PCR技术进步具有重要的意义。本文应用基因工程改造野生型Taq DNA聚合酶,研究了Taq DNA聚合酶突变体（STaq）的酶学性质,进一步采用单克隆抗体实现了STaq的热启动修饰,在探讨了热启动STaq（HS-STaq）PCR扩增特性的基础上,将其应用于乳制品掺假检测。主要的研究内容及结论如下:（1）STaq的重组表达。设计并成功合成staq基因,构建了p ET-28a重组表达载体,实现了STaq在大肠杆菌中的重组表达。同时,优化了STaq诱导表达条件:诱导温度25℃、IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导时间6 h。采用镍离子亲和层析等技术制备了电泳纯STaq储存液,其酶活浓度为9.4×104U/m L。（2）STaq酶学性质研究。为STaq配备了最适PCR缓冲液:p H9.0,20 mmol/L Tris-HCl、2 mmol/L Mg SO4、20 mmol/L KCl、10 mmol/L（NH4）2SO4、0.05%Triton X-100。STaq在95℃热处理2 h后,保持了75%以上的聚合酶活性。STaq最适PCR延伸温度为72℃,延伸速率可达1 s/kb,且能从基因组模板扩增得到GC含量高达73.1%的目的基因。STaq可耐受0.04%的SDS或100 mmol/L的Na Cl,且能实现鼠尾基因组DNA粗提取液及50%（v/v）血液的直接PCR扩增。（3）HS-STaq的制备与性质研究。委托制备并筛选得到高效可逆封闭STaq活性的单克隆抗体6C1。同时,优化了STaq与抗体6C1孵育制备HS-STaq的条件:摩尔比1:2、温度0℃、孵育时间60 min。所制备的HS-STaq的热启动温度大于70℃;在95℃下处理80 s可以完全释放聚合酶活性,热启动修饰过程的酶活损失率仅5.2%。相对于STaq,HS-STaq PCR扩增的灵敏度提高了10倍,PCR反应特异性得到明显提高。（4）HS-STaq在乳制品掺假检测中的应用。将HS-STaq初步应用于羊乳制品中牛源成分、牛乳制品中大豆源成分的检测。建立了相关的直接PCR检测方法,在直接PCR检测体系中羊乳样品最高添加量为15%（v/v）,牛乳样品的最高添加量为20%（v/v）;检测灵敏度均为0.1 ng基因组DNA/μL。
王倩倩[9]（2019）在《基于PLP-RCA的唐氏综合症产前筛查方法的建立与优化》文中进行了进一步梳理研究背景及目的:唐氏综合症（DS）是一种常见的不可治愈的染色体病,目前只能通过产前干预的手段阻止患儿的出生。传统的产前筛查方法假阳性率高;快速产前诊断方法其创伤性的取样方式对孕妇和胎儿有一定的损伤风险;无创DNA产前筛查方法借助于成熟的测序公司,成本高、在偏远地区不易普及,因此建立安全、有效、易于推广的DS产前筛查方法至关重要。母体胎儿游离核酸是无创产前诊断最好的样品,但是因其含量低,受母体背景干扰等问题,需要灵敏度高、特异性好的方法对其检测以实现对DS产前筛查。本课题基于锁式探针-滚环扩增（PLP-RCA）具有对单核苷酸多态性（SNP）基因分型及定量能力,拟建立一种灵敏度高、特异性好的PLP-RCA用于DS产前筛查,为无创性的DS产前筛查提供新方法。研究方法:（1）依据胎儿特异表达的基因杂合型“RNA-SNP”等位基因比值定量的方法,选择杂合率较高的胎儿特异基因的SNP。对PLP-RCA的反应体系进行优化,对靶分子浓度与终点荧光值之间的定量关系进行检测,实现PLP-RCA对SNP等位基因分型及比值定量。（2）改进的指数线性PCR（imLATE-PCR）对靶分子进行信号放大产生单链DNA,经过信号放大的靶分子进行PLP-RCA均得到扩增产物,结合imLATE-PCR,PLP-RCA的检测灵敏度提高。（3）用合成的靶分子制备正常人和DS患者的模拟样品,采用荧光定量PLP-RCA对模拟样品进行筛查;用合成的靶分子制备正常人和DS患者的血浆模拟样品,模拟临床样品的待测环境,采用荧光定量PLP-RCA对血浆模拟样品进行筛查。研究结果:（1）确定了21号染色体COL6A2、PLAC4基因上杂合率较高的rs1044598位点、rs7717位点、rs59066201位点,三个位点在人群中的理论覆盖率达到了84.7%。针对3个SNP位点设计锁式探针,优化了PLP-RCA反应体系,实现了对胎儿特异基因上SNP位点的基因分型。荧光定量PLP-RCA分析了两倍浓度差的靶分子与终点荧光值之间有较好的线性关系,可检测到1 nM的靶分子,实现了对胎儿特异基因上SNP等位基因比值定量。（2）设计了3个SNP位点imLATE-PCR的大量引物与限制性引物,均得到单链DNA产物。以这些产物为模板,进行荧光定量PLP-RCA实验并分析了扩增产物浓度与终点荧光值之间的关系,结果二者之间具有较好的线性相关性,可检测到1 pM的靶分子,PLPRCA检测灵敏提高。（3）荧光定量PLP-RCA对正常人和DS患者的模拟样品进行检测,正常人模拟样品SNP等位基因比值接近理论值1:1,DS患者模拟样品SNP等位基因比值接近理论值2:1或1:2,实现了对DS患者模拟样品的检测,进一步实验发现此方法初步实现了对DS患者血浆模拟样品的检测。结论:本研究对PLP-RCA反应体系进行优化,建立了特异性检测唐氏综合症相关SNP位点的方法,实现了PLP-RCA对胎儿特异基因上SNP位点的分型定量,通过增加改进的指数线性PCR反应,提高了PLP-RCA检测灵敏度,初步实现了对DS模拟样品的筛查,为下一阶段临床样品的检测奠定了基础。
胡亚赛[10]（2019）在《基于单链DNA开关的多功能生物电路》文中研究表明合成生物电路是利用生物分子构建具有逻辑控制功能的生物体系,是近年来合成生物学的重要研究领域。合成生物电路是将生物分子通过工程化的方法开发为不同的功能元件,将这些模块化元件再组装成人工调控系统。生物电路的开发目的是为了使人们能够以工程化的方式对细胞生物功能进行调控。目前,合成生物电路的可编程性、灵活性以及模块化设计使其成为了一种重要的生物技术。本课题研究了基于单链DNA开关调控的多功能生物电路的工程化构建方法。其中,计算机辅助设计的单链DNA“toehold”开关通过链置换反应机理可以实现高特异性与目的核酸分子的识别。基于此,我们将DNA开关作为一个核心控制元件,实现了驱动简单的单向式甚至是循环式生物电路系统,并对单链DNA开关驱动的级联电路进行了构建及性能分析。此外,我们尝试了将DNA开关用于无细胞蛋白表达系统中的基因表达调控,成功的证明了长单链DNA分子（982bp）也可以在体外人工生物系统中实现完整的基因表达功能。本研究开发了以单链DNA“toehold”开关为核心控制元件的标准化、模块化生物电路构建技术,可以为今后复杂的人工生物电路的构建提供坚定的技术基础,同时应用于疾病诊断、基因网络以及人造生命等研究领域中。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 PCR技术 |
| 1.1.1 PCR反应原理和动力学研究 |
| 1.1.2 PCR分类 |
| 1.1.3 常规PCR局限性 |
| 1.2 长片段PCR |
| 1.2.1 长片段PCR发展 |
| 1.2.2 长片段PCR组分优化 |
| 1.2.3 长片段PCR应用 |
| 1.2.4 长片段PCR优势与不足 |
| 1.3 热稳定性研究 |
| 1.3.1 DNA聚合酶作用机理 |
| 1.3.2 dNTP水解 |
| 1.3.3 dNTP末端修饰现状 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 dNTP末端修饰氨基设计与合成 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 dNTP钠盐转型 |
| 2.2.4 CDI活化制备dTTP-NH_2 |
| 2.2.5 PPh_3/(PyS)_2活化制备dTTP-NH_2 |
| 2.2.6 DCC活化制备dNTP-NH_2 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 设计思路 |
| 2.3.2 dNTP-NH_2合成方案 |
| 2.3.3 产物分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 热稳定性测试和酶反应动力学分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 热稳定性测试 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 热稳定性分析 |
| 3.3.2 酶反应动力学分析 |
| 3.3.3 水解分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 PCR扩增 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 大肠杆菌培养与质粒提取 |
| 4.2.4 DNA聚合酶识别 |
| 4.2.5 筛选DNA聚合酶 |
| 4.2.6 扩增时间 |
| 4.2.7 长片段扩增 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 DNA聚合酶产物识别分析 |
| 4.3.2 DNA聚合酶筛选 |
| 4.3.3 dNTP-NH_2扩增时间分析 |
| 4.3.4 dNTP-NH_2长片段扩增分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 拮抗陈旧法医DNA检材抑制剂的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 主要缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 立题背景 |
| 1.2 检测方法研究现状 |
| 1.2.1 感官分析 |
| 1.2.2 光谱分析 |
| 1.2.3 色谱和质谱分析 |
| 1.2.4 电泳分析 |
| 1.2.5 免疫分析 |
| 1.2.6 基于聚合酶链式反应的分析 |
| 1.2.7 基于等温扩增的分析 |
| 1.3 本论文的研究目的及意义 |
| 1.4 本论文的研究内容 |
| 第二章 基于功能化引物设计的PCR方法检测牛肉中的马肉成分 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 肉样品准备 |
| 2.3.2 肉样品DNA提取 |
| 2.3.3 PCR扩增及分析 |
| 2.3.4 方法可行性验证 |
| 2.3.5 扩增条件优化 |
| 2.3.6 不同循环数时方法的灵敏度 |
| 2.3.7 特异性验证 |
| 2.3.8 加工肉制品检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 实验原理 |
| 2.4.2 方法可行性验证 |
| 2.4.3 扩增条件优化 |
| 2.4.4 不同循环数时的灵敏度分析 |
| 2.4.5 特异性验证 |
| 2.4.6 加工肉制品检测 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 基于单链结合蛋白增强的荧光偏振策略检测牛肉中的鸡肉成分 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 肉样品准备及DNA提取 |
| 3.3.2 PCR扩增 |
| 3.3.3 荧光偏振分析 |
| 3.3.4 方法可行性验证 |
| 3.3.5 实验条件优化 |
| 3.3.6 灵敏度分析 |
| 3.3.7 特异性验证 |
| 3.3.8 实际样品检测 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 实验原理 |
| 3.4.2 方法可行性验证 |
| 3.4.3 实验条件优化 |
| 3.4.4 灵敏度分析 |
| 3.4.5 特异性验证 |
| 3.4.6 加工肉制品检测 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 基于环介导等温扩增的荧光偏振方法快速检测牛肉中的猪肉成分 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 肉样品准备及DNA提取 |
| 4.3.2 LAMP扩增及分析 |
| 4.3.3 q PCR扩增 |
| 4.3.4 FITC标记引物的选择 |
| 4.3.5 反应条件优化 |
| 4.3.6 灵敏度检测 |
| 4.3.7 特异性验证 |
| 4.3.8 重复性验证 |
| 4.3.9 实际样品检测 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 实验原理 |
| 4.4.2 FITC标记引物的选择 |
| 4.4.3 反应条件优化 |
| 4.4.4 灵敏度分析 |
| 4.4.5 特异性验证 |
| 4.4.6 重复性验证 |
| 4.4.7 实际样品检测 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 基于多重PCR的侧向层析试纸方法同时检测鸡肉、鸭肉和猪肉成分 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 金纳米粒子(AuNPs)的制备 |
| 5.3.2 金-探针偶联物(AuNP-RP)的制备 |
| 5.3.3 LFS的构建 |
| 5.3.4 肉样品准备及DNA提取 |
| 5.3.5 PCR扩增 |
| 5.3.6 LFS检测 |
| 5.3.7 qPCR扩增 |
| 5.3.8 NAT标记引物的验证 |
| 5.3.9 可行性验证 |
| 5.3.10 扩增条件优化 |
| 5.3.11 LFS参数优化 |
| 5.3.12 灵敏度分析 |
| 5.3.13 特异性验证 |
| 5.3.14 实际样品检测 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 实验原理 |
| 5.4.2 NAT标记引物的验证 |
| 5.4.3 方法可行性验证 |
| 5.4.4 扩增条件优化 |
| 5.4.5 LFS参数优化 |
| 5.4.6 灵敏度检测 |
| 5.4.7 特异性验证 |
| 5.4.8 实际样品检测 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 基于重组酶聚合酶扩增的侧向层析试纸方法同时检测鸭肉、鸡肉和猪肉成分 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与仪器 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 AuNPs的制备 |
| 6.3.2 AuNPs与FITC抗体偶联物(AuNP-Ab)的制备 |
| 6.3.3 LFS的制备 |
| 6.3.4 肉样品准备及DNA提取 |
| 6.3.5 mRPA扩增 |
| 6.3.6 LFS检测 |
| 6.3.7 qPCR扩增 |
| 6.3.8 引物浓度优化 |
| 6.3.9 方法可行性验证 |
| 6.3.10 单组分检测 |
| 6.3.11 相同趋势的多组分检测 |
| 6.3.12 不同趋势的多组分检测 |
| 6.3.13 特异性验证 |
| 6.3.14 稳定性检测 |
| 6.3.15 实际样品检测 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 实验原理 |
| 6.4.2 引物浓度优化 |
| 6.4.3 方法可行性验证 |
| 6.4.4 单组分检测 |
| 6.4.5 相同趋势的多组分检测 |
| 6.4.6 不同趋势的多组分检测 |
| 6.4.7 特异性验证 |
| 6.4.8 稳定性验证 |
| 6.4.9 实际样品检测 |
| 6.5 结论 |
| 第七章 基于表面增强拉曼的侧向层析试纸方法同时检测牛肉中的多种肉类成分 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料与仪器 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验仪器 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 AuNPs的制备 |
| 7.3.2 拉曼信标的制备 |
| 7.3.3 拉曼信标与探针的偶联 |
| 7.3.4 LFS的制备 |
| 7.3.5 肉样品准备及DNA提取 |
| 7.3.6 mRPA扩增 |
| 7.3.7 LFS检测 |
| 7.3.8 qPCR扩增 |
| 7.3.9 可行性验证 |
| 7.3.10 信号分子浓度优化 |
| 7.3.11 单组分检测 |
| 7.3.12 相同趋势的多组分检测 |
| 7.3.13 不同趋势的多组分检测 |
| 7.3.14 特异性验证 |
| 7.3.15 实际样品检测 |
| 7.4 结果与讨论 |
| 7.4.1 实验原理 |
| 7.4.2 材料表征结果 |
| 7.4.3 信号分子浓度优化 |
| 7.4.4 可行性研究 |
| 7.4.5 单组分掺假样品的检测 |
| 7.4.6 多组分掺假样品的检测 |
| 7.4.7 特异性验证 |
| 7.4.8 实际样品检测 |
| 7.5 结论 |
| 第八章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的学术活动及成果清单 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1. 多杀菌素 |
| 1.1.1. 多杀菌素及其衍生物 |
| 1.1.2. 多杀菌素生物合成基因簇 |
| 1.1.3. 多杀菌素生物合成 |
| 1.1.4. 多杀菌素产量提高策略 |
| 1.2. 基因编辑技术 |
| 1.2.1. DNA体外组装技术 |
| 1.2.2. DNA体内同源重组技术 |
| 1.3. 立项依据和研究内容 |
| 第二章 多杀菌素生物合成基因簇的直接克隆和异源表达 |
| 2.1. 实验材料 |
| 2.1.1. 菌种和质粒 |
| 2.1.2. 生物化学与分子生物学试剂 |
| 2.1.3. 重组引物和DNA测序 |
| 2.2. 仪器设备 |
| 2.3. 实验方法 |
| 2.3.1. 菌种培养及保藏 |
| 2.3.2. DNA制备与纯化方法 |
| 2.3.3. 大肠杆菌DNA同源重组工程标准操作程序 |
| 2.3.4. 重组克隆鉴定 |
| 2.3.5. ExoCET直接克隆技术标准操作程序 |
| 2.3.6. 链霉菌接合转移 |
| 2.3.7. 链霉菌发酵和产物分析 |
| 2.4. 实验过程与结果分析 |
| 2.4.1. 多杀菌素生物合成基因簇载体的构建 |
| 2.4.2. 多杀菌素链霉菌异源表达菌株的构建 |
| 2.4.3. 多杀菌素链霉菌异源表达菌株的发酵产物分析 |
| 2.5. 小结与讨论 |
| 第三章 开发DNA多片段组装技术构建多操纵子人工基因簇提高多杀菌素产量 |
| 3.1. 实验材料 |
| 3.1.1. 菌种和质粒 |
| 3.1.2. 生物化学与分子生物学试剂 |
| 3.1.3. 重组引物 |
| 3.2. 仪器设备 |
| 3.3. 实验方法 |
| 3.3.1. ExoCET多片段组装标准操作程序 |
| 3.3.2. Gibson多片段组装 |
| 3.3.3. 实时荧光定量PCR |
| 3.4. 实验过程与结果分析 |
| 3.4.1. 过表达多杀菌素PKS基因提高多杀菌素产量 |
| 3.4.2. 人工多杀菌素基因簇的设计 |
| 3.4.3. ExoCET多片段组装构建人工多杀菌素基因簇 |
| 3.4.4. 人工多杀菌素基因簇的异源表达 |
| 3.5. 小结与讨论 |
| 第四章 开发RedEx基因编辑技术用于多杀菌素结构衍生 |
| 4.1. 实验材料 |
| 4.1.1. 菌种和质粒 |
| 4.1.2. 生物化学与分子生物学试剂 |
| 4.1.3. 重组引物 |
| 4.2. 仪器设备 |
| 4.3. 实验方法 |
| 4.3.1. RedEx基因编辑技术标准操作程序 |
| 4.3.2. 多杀菌素衍生物的分离纯化 |
| 4.4. 实验过程与结果分析 |
| 4.4.1. 丁烯基多杀菌素基因簇的设计 |
| 4.4.2. RedEx基因编辑技术的建立及其在丁烯基多杀菌素基因簇构建中的应用 |
| 4.4.3. RedEx技术无缝敲除spnK基因构建多杀菌素JL基因簇 |
| 4.4.4. RedEx与其他基因编辑技术的比较 |
| 4.5. 小结与讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 组合酶切割纠错法与MutS结合纠错法研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 多重纠错体系的设计与构建 |
| 2.3.2 DNA模板设计与制备 |
| 2.3.3 DNA模板克隆与测序分析 |
| 2.3.4 组合酶介导DNA合成错误纠正 |
| 2.3.4.1 错配切割酶筛选 |
| 2.3.4.2 组合酶筛选 |
| 2.3.4.3 组合酶纠错体系优化 |
| 2.3.4.4 基于组合酶纠错的DNA合成技术应用 |
| 2.3.5 磁珠@MutS介导DNA合成错误纠正 |
| 2.3.5.1 eMutS蛋白表达 |
| 2.3.5.2 磁珠@MutS制备 |
| 2.3.5.3 磁珠@MutS功能验证 |
| 2.3.5.4 磁珠@MutS纠错方法建立 |
| 2.3.5.5 磁珠@MutS纠错体系优化 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 DNA模板分析 |
| 2.4.2 单种错配切割酶筛选结果 |
| 2.4.3 组合酶筛选结果 |
| 2.4.4 组合酶纠错条件优化 |
| 2.4.4.1 组合酶反应体系及温度的优化 |
| 2.4.4.2 组合酶反应时间优化结果 |
| 2.4.4.3 组合酶酶用量优化结果 |
| 2.4.4.4 组合酶纠错次数分析 |
| 2.4.5 基于组合酶纠错的DNA合成技术应用 |
| 2.4.6 磁珠@MutS纠错性能评估 |
| 2.4.7 磁珠@TaqMutS纠错结果 |
| 2.5 讨论 |
| 3 磁性SERS免疫层析用于DNA错配序列及肿瘤标志物的检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料及试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 超顺磁性Fe_3O_4纳米颗粒的制备 |
| 3.3.2 胶体金纳米颗粒的制备 |
| 3.3.3 MutS蛋白修饰的金壳磁性SERS标签的制备 |
| 3.3.4 树莓状金壳磁性纳米颗粒的制备 |
| 3.3.5 树莓状金壳磁性SERS标签的制备 |
| 3.3.6 基于TaqMutS修饰磁珠的DNA错配检测实验 |
| 3.3.7 三通道免疫层析试纸条的制备 |
| 3.3.8 拉曼检测条件 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 TaqMutS修饰磁性SERS标签用于DNA错配序列的实验设计 |
| 3.4.2 TaqMutS@金壳磁珠的性能表征 |
| 3.4.3 基于TaqMutS修饰磁珠的DNA错配检测实验结果 |
| 3.4.4 磁性SERS免疫层析用于肿瘤标志物联合检测的设计思路 |
| 3.4.5 树莓状金壳磁性SERS标签的结构与性能表征 |
| 3.4.6 免疫层析系统的优化 |
| 3.4.7 磁性SERS免疫层析检测肿瘤标志物的性能评估 |
| 3.5 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 DNA合成错误纠正技术研究进展 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.1.1 古菌简述 |
| 1.1.2 DNA复制概述 |
| 1.1.3 DNA聚合酶及复制相关蛋白简述 |
| 1.1.4 PCR技术简述 |
| 1.2 本研究的意义 |
| 1.2.1 增加对DNA复制相关蛋白功能的认知 |
| 1.2.2 促进DNA复制相关蛋白的应用 |
| 1.3 本文的研究路线 |
| 第二章 Pol D聚合酶大小亚基以及复制相关蛋白的表达纯化 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 药品与试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原核表达Pol D以及复制相关蛋白 |
| 2.2.2 Pol D大小亚基及复制相关蛋白的纯化 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Pol D聚合酶的蛋白纯化结果 |
| 2.3.2 复制相关蛋白的纯化结果 |
| 2.3.3 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 Pol D聚合酶大亚基与小亚基功能的研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.1 药品与试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 蛋白材料与引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Pol D大亚基DP2 聚合酶延伸活性研究 |
| 3.2.2 Pol D小亚基DP1 核酸外切酶活性研究 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 DP2 聚合酶延伸活性实验 |
| 3.3.2 DP1 核酸外切酶活性实验 |
| 3.3.3 讨论 |
| 小结 |
| 第四章 DNA复制相关蛋白提高PCR反应保真度功能的初步研究 |
| 引言 |
| 4.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.1 酶与引物 |
| 4.1.2 药品与试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 试剂盒 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Taq与 Laf U的 PCR产物保真度研究 |
| 4.2.2 UNG,Endo Q,Endo MS对 PCR产物保真度的影响研究 |
| 4.2.3 测序 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 Taq与 Laf U的 PCR结果 |
| 4.3.2 修复因子添加量的确定 |
| 4.3.3 测序结果的统计和分析 |
| 4.3.4 讨论 |
| 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 附录 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 问题的提出与研究意义 |
| 1.1.1 问题的提出 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 羊痘病毒的病原学特性 |
| 1.2.2 羊痘病毒基因组学 |
| 1.2.3 牛结节性皮肤病病毒基因的组成及其功能 |
| 1.2.4 牛结节性皮肤病病毒的形态学和生物学特性 |
| 1.2.5 牛结节性皮肤病的流行病学 |
| 1.2.6 牛结节性皮肤病的临床症状 |
| 1.2.7 牛结节性皮肤病诊断方法研究进展 |
| 1.3 研究的目的和研究内容 |
| 1.3.1 研究目的 |
| 1.3.2 主要研究内容 |
| 2 CaPV-LAMP检测方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 准菌(毒)株 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 序列分析与引物设计 |
| 2.3.2 羊痘病毒的增殖 |
| 2.3.3 病毒DNA的提取 |
| 2.3.4 CaPV LAMP检测体系的优化 |
| 2.3.5 特异性试验 |
| 2.3.6 敏感性试验 |
| 2.3.7 重复性和稳定性试验 |
| 2.3.8 LAMP可视法的建立 |
| 2.3.10 CaPV-LAMP方法的应用 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 CaPV序列分析及LAMP引物设计 |
| 2.4.2 CaPV的增殖 |
| 2.4.3 CaPV-LAMP方法的建立 |
| 2.4.4 CaPV-LAMP特异性 |
| 2.4.5 CaPV-LAMP敏感性 |
| 2.4.6 重复性和稳定性试验 |
| 2.4.7 LAMP可视法的建立 |
| 2.4.8 可视法与仪器法检测敏感性比较分析 |
| 2.4.9 可视法特异性 |
| 2.4.10 CaPV-LAMP方法的应用 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 牛结节性皮肤病病毒通用型TaqMan MGB实时荧光定量PCR方法的建立及试剂盒研制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 标准菌(毒)株 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.3 研究方法 |
| 3.3.1 引物探针设计 |
| 3.3.2 实时荧光定量PCR方法的建立 |
| 3.3.3 特异性试验 |
| 3.3.4 敏感性试验 |
| 3.3.5 重复性试验 |
| 3.3.6 稳定性试验 |
| 3.3.7 临床样品的检测 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 目的基因扩增及阳性质控的制备 |
| 3.4.2 反应条件的优化 |
| 3.4.3 特异性试验 |
| 3.4.4 敏感性试验 |
| 3.4.5 标准曲线 |
| 3.4.6 重复性试验 |
| 3.4.7 试剂盒稳定性试验 |
| 3.4.8 临床样品检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 LSDV野毒株与疫苗株双重TaqMan MGB实时荧光定量PCR方法的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 标准菌(毒)株 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.3 研究方法 |
| 4.3.1 引物与探针的设计 |
| 4.3.2 重组质粒标准品的构建 |
| 4.3.3 反应条件的优化及标准曲线的建立 |
| 4.3.4 特异性试验 |
| 4.3.5 敏感性试验 |
| 4.3.6 重复性试验 |
| 4.3.7 临床样品的检测 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 目的基因扩增及阳性质控制备 |
| 4.4.2 反应条件的优化 |
| 4.4.3 标准曲线的建立 |
| 4.4.4 特异性试验 |
| 4.4.5 敏感性试验 |
| 4.4.6 重复性试验 |
| 4.4.7 临床样品检测 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 ORF005和ORF132蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与试剂 |
| 5.2.1 主要生物材料 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 主要试剂配制 |
| 5.3 研究方法 |
| 5.3.1 PCR引物设计 |
| 5.3.2 氨基酸理化性质分析 |
| 5.3.3 蛋白信号肽与跨膜结构分析 |
| 5.3.4 蛋白结构预测 |
| 5.3.5 B细胞表位预测 |
| 5.3.6 氨基酸同源性分析 |
| 5.3.7 基因的扩增及鉴定 |
| 5.3.8 重组质粒的构建 |
| 5.3.9 重组供体质粒的构建及鉴定 |
| 5.3.10 重组穿梭载体r Bacmid的构建与鉴定 |
| 5.3.11 重组杆状病毒的制备 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 ORF005氨基酸的理化性质 |
| 5.4.2 蛋白信号肽与跨膜结构分析 |
| 5.4.3 蛋白结构预测 |
| 5.4.4 抗原表位分析 |
| 5.4.5 氨基酸同源性分析 |
| 5.4.6 ORF132基因PCR扩增结果 |
| 5.4.7 克隆质粒双酶切鉴定 |
| 5.4.8 重组穿梭质粒rBacmid的鉴定 |
| 5.4.9 转染后的细胞病变 |
| 5.4.10 rBacmid-ORF132重组病毒感染后的CPE观察 |
| 5.4.11 重组杆状病毒感染后的IFA鉴定 |
| 5.4.12 不同代次重组病毒rBacmid-ORF132滴度测定 |
| 5.4.13 蛋白表达及鉴定 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 6 我国边境地区牛结节性皮肤病调查及XJ1917株的分离与鉴定 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与试剂 |
| 6.2.1 细胞株 |
| 6.2.2 主要试剂 |
| 6.2.3 主要仪器 |
| 6.2.4 样本来源 |
| 6.3 研究方法 |
| 6.3.1 样本前处理 |
| 6.3.2 抗体水平检测 |
| 6.3.3 病毒核酸检测 |
| 6.3.4 病毒分离 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 抗体水平检测结果 |
| 6.4.2 病毒核酸检测结果 |
| 6.4.3 LSDV新疆分离株(XJ1917株)CPE结果 |
| 6.4.4 LSDV新疆分离株(XJ1917株)PCR扩增结果 |
| 6.4.5 LSDV(XJ1917株)EEV基因测序结果分析 |
| 6.4.6 LSDV(XJ1917株)ORF132 基因测序结果分析 |
| 6.4.7 实时荧光定量PCR检测病毒增值情况 |
| 6.4.8 XJ1917分离株TCID_(50)滴度测定结果 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 本章小结 |
| 7 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 本研究的创新点 |
| 7.3 后续研究工作的展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读学位期间发表的论文目录 |
| B.作者在攻读学位期间承担的科研项目及成果目录 |
| C.学位论文数据集 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 PCR技术 |
| 1.1.1 PCR技术的发展简史 |
| 1.1.2 PCR技术原理 |
| 1.1.3 PCR技术的应用 |
| 1.2 直接PCR技术 |
| 1.2.1 直接PCR技术的建立 |
| 1.2.2 直接PCR技术的研究进展 |
| 1.2.3 直接PCR检测的影响因素 |
| 1.3 Taq DNA聚合酶 |
| 1.3.1 Taq DNA聚合酶的来源 |
| 1.3.2 Taq DNA聚合酶的结构 |
| 1.3.3 Taq DNA聚合酶的酶活特征 |
| 1.4 Taq DNA聚合酶改造的研究现状 |
| 1.4.1 Taq DNA聚合酶的基因改造 |
| 1.4.2 Taq DNA聚合酶的热启动修饰 |
| 1.5 本课题的研究意义和内容 |
| 1.5.1 研究目的和意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 DNA聚合酶突变体的重组表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验仪器及材料 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.2.3 主要实验试剂 |
| 2.2.4 常用试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Taq DNA聚合酶改造策略 |
| 2.3.2 STaq密码子优化 |
| 2.3.3 staq基因合成 |
| 2.3.4 STaq重组载体的构建 |
| 2.3.5 STaq小量表达鉴定 |
| 2.3.6 STaq诱导表达条件优化 |
| 2.3.7 STaq大量表达及分离纯化 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 staq基因合成 |
| 2.4.2 STaq重组载体的构建 |
| 2.4.3 STaq小量表达鉴定 |
| 2.4.4 STaq诱导表达条件优化 |
| 2.4.5 STaq分离纯化结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 DNA聚合酶突变体的酶学性质研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验仪器及材料 |
| 3.2.1 细胞、血液及动物组织 |
| 3.2.2 质粒 |
| 3.2.3 仪器与设备 |
| 3.2.4 主要实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 样品基因组DNA提取 |
| 3.3.2 STaq最适PCR缓冲体系 |
| 3.3.3 热稳定性研究 |
| 3.3.4 最适延伸温度 |
| 3.3.5 PCR扩增性能 |
| 3.3.6 耐PCR抑制剂性能研究 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 STaq最适PCR缓冲体系 |
| 3.4.2 热稳定性研究 |
| 3.4.3 最适延伸温度 |
| 3.4.4 PCR扩增性能 |
| 3.4.5 耐抑制剂性能研究 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 热启动DNA聚合酶的制备与性质研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验仪器及材料 |
| 4.2.1 质粒 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.2.3 主要实验试剂 |
| 4.3 常用试剂的配制 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 单克隆抗体筛选 |
| 4.4.2 HS-STaq制备条件优化 |
| 4.4.3 HS-STaq的热启动条件 |
| 4.4.4 HS-STaq性质研究 |
| 4.5 结果与讨论 |
| 4.5.1 STaq热启动抗体筛选 |
| 4.5.2 HS-STaq制备条件优化 |
| 4.5.3 HS-STaq的热启动 |
| 4.5.4 HS-STaq性质研究 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 热启动DNA聚合酶在乳制品掺假检测中的应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验仪器及材料 |
| 5.2.1 仪器与设备 |
| 5.2.2 主要实验试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 乳制品基因组DNA提取 |
| 5.3.2 直接PCR体系中样品添加量确定 |
| 5.3.3 直接PCR检测的特异性 |
| 5.3.4 直接PCR检测的灵敏度 |
| 5.3.5 直接PCR检测的检测限 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 直接PCR体系中样品添加量确定 |
| 5.4.2 直接PCR检测的特异性 |
| 5.4.3 直接PCR检测的灵敏度 |
| 5.4.4 直接PCR检测的检测限 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、研究创新点 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 唐氏综合症 |
| 1.1.1 唐氏综合症概述 |
| 1.1.2 唐氏综合症产前筛查与诊断方法概述 |
| 1.1.3 无创性产前筛查方法的研究进展 |
| 1.2 滚环扩增技术 |
| 1.2.1 滚环扩增的分类及特征 |
| 1.2.2 滚环扩增的研究进展 |
| 1.2.3 基于PLP-RCA检测单核苷酸多态性 |
| 1.3 指数线性PCR技术 |
| 1.4 本课题来源、研究思路及主要内容 |
| 1.4.1 本课题来源及研究意义 |
| 1.4.2 本课题研究思路 |
| 1.4.3 主要研究内容 |
| 第2章 PLP-RCA定量检测体系建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SNP位点选择 |
| 2.2.2 PLP-RCA引物设计 |
| 2.2.3 RCA产物的电泳检测 |
| 2.3 PLP-RCA反应体系优化 |
| 2.3.1 连接酶与聚合酶的选择 |
| 2.3.2 酶连反应与酶切反应时间优化 |
| 2.3.3 荧光定量RCA反应中聚合酶、d NTP的优化 |
| 2.3.4 PLP-RCA方法特异性分析 |
| 2.3.5 靶分子浓度与终点荧光值之间的定量关系 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 连接酶与聚合酶的选择 |
| 2.4.2 酶连反应与酶切反应时间优化 |
| 2.4.3 荧光定量RCA反应中聚合酶、d NTP的优化 |
| 2.4.4 PLP-RCA方法特异性 |
| 2.4.5 靶分子浓度与终点荧光值之间的定量关系 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 imLATE-PCR与 PLP-RCA联用增加检测灵敏度 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法与过程 |
| 3.2.1 imLATE-PCR引物设计 |
| 3.2.2 imLATE-PCR反应 |
| 3.2.3 imLATE-PCR 产物进行 PLP-RCA 实验 |
| 3.2.4 imLATE-PCR产物浓度与终点荧光值的定量关系 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 imLATE-PCR引物设计及产物分析 |
| 3.3.2 imLATE-PCR 产物进行 PLP-RCA 实验 |
| 3.3.3 imLATE-PCR产物浓度与终点荧光值的定量关系 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 PLP-RCA对模拟样品的定量 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验材料 |
| 4.2 实验过程 |
| 4.2.1 模拟样品PLP-RCA定量分型 |
| 4.2.2 血浆模拟样品的初步定量 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 模拟样品PLP-RCA定量分型 |
| 4.3.2 血浆模拟样品的初步定量 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 研究总结 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 可进一步开展的研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及研究成果 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 合成生物电路 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 体内生物工程应用 |
| 1.1.3 体外生物工程应用 |
| 1.2 合成生物电路的分子机理 |
| 1.2.1 基于转录因子的调控网络 |
| 1.2.2 基于基因编辑的调控网络 |
| 1.2.3 Toehold驱动的核酸分子网络 |
| 1.2.4 工程标准化 |
| 1.3 本课题的研究内容与思路 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 DNA核酸序列 |
| 2.1.2 实验菌株与质粒 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 实验溶液配置 |
| 2.2 单链DNA开关反应系统 |
| 2.2.1 单向式系统反应体系及方法 |
| 2.2.2 链取代扩增介导的循环反应 |
| 2.3 体外级联生化反应 |
| 2.3.1 切口酶介导的链取代扩增反应体系 |
| 2.3.2 体外级联反应体系 |
| 2.4 蛋白的体外生化合成 |
| 2.4.1 双链模板制备方法 |
| 2.4.2 单链DNA模板制备方法 |
| 2.4.3 无细胞蛋白系统的构建 |
| 2.4.4 体外基因表达方法 |
| 第3章 单链DNA开关构建 |
| 3.1 单链DNA开关设计 |
| 3.1.1 原理性设计 |
| 3.1.2 序列编程设计 |
| 3.1.3 结果与讨论 |
| 3.2 单向式生化反应系统 |
| 3.2.1 原理性设计 |
| 3.2.2 单向式生化系统分析 |
| 3.2.3 结果与讨论 |
| 3.3 循环式生化反应系统 |
| 3.3.1 原理性设计 |
| 3.3.2 生物酶的影响 |
| 3.3.3 循环式生化系统分析 |
| 3.3.4 结果与讨论 |
| 第4章 体外级联生化反应系统 |
| 4.1 系统设计 |
| 4.1.1 原理性设计 |
| 4.1.2 级联反应序列设计 |
| 4.1.3 结果与讨论 |
| 4.2 级联反应生物电路 |
| 4.2.1 系统的方法性分析 |
| 4.2.2 系统的检测与结果分析 |
| 4.2.3 结果与讨论 |
| 4.3 系统性能分析 |
| 4.3.1 反应体系的确认 |
| 4.3.2 探针序列的筛选 |
| 4.3.3 多重循环系统灵敏性分析 |
| 4.3.4 结果与讨论 |
| 第5章 单链DNA开关调控的体外基因表达 |
| 5.1 体外基因表达调控系统设计 |
| 5.1.1 原理性设计 |
| 5.1.2 基因表达序列设计 |
| 5.1.3 结果与讨论 |
| 5.2 长单链DNA制备 |
| 5.2.1 核酸外切酶降解法 |
| 5.2.2 切口酶介导的链取代扩增法 |
| 5.2.3 不对称PCR法 |
| 5.2.4 长单链DNA的分离纯化 |
| 5.2.5 结果与讨论 |
| 5.3 系统性能分析 |
| 5.3.1 无细胞蛋白系统活性鉴定及优化 |
| 5.3.2 体外调控系统的验证 |
| 5.3.3 结构的影响 |
| 5.3.4 序列的影响 |
| 5.3.5 单链DNA开关的实时调控系统 |
| 5.3.6 结果与讨论 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
