朱裕敏,刘荭,毛明光[1]（2021）在《海水鱼神经坏死病毒致病机理研究进展》文中研究说明神经坏死病毒（nervous necrosis virus, NNV）主要分布在地中海和太平洋西海岸,已在120多种鱼中被检测到,能引起鱼类病毒性神经坏死病（viral nervous necrosis, VNN）,是对海水鱼类危害重大的病原之一。目前,随着神经坏死病毒的基因序列、类型、诊断和预防技术等方面研究的不断深入,其致病机理的报道也越来越多。本文概述了病毒附着、致病基因、细胞凋亡以及免疫逃避等几个方面的研究现状。
魏盟智[2]（2020）在《利用基因工程微藻预防石斑鱼神经坏死病研究》文中指出石斑鱼是一种富含多种矿物质元素和维生素,深受消费者喜爱的海水食用鱼,也是我国东南沿海（福建、广东、海南）等地区重要水产养殖鱼类。近年来,在人工养殖石斑鱼过程中深受虹彩病毒病、肠炎、寄生虫病等多种疾病困扰,其中尤以病毒性神经坏死病（viral nervous necrosis,VNN）最为严重,该病在损害养殖户利益的同时也极大阻碍了我国水产养殖业的发展。VNN主要爆发于海水鱼类的育苗期间即幼鱼期和稚鱼期,是由病原神经坏死病毒（nervous necrosis virus,NNV）入侵鱼体,导致患病鱼行为异常,运动失衡,厌食绝食,最终死亡的一种大危害性、高发生率的病毒性疾病。距今为止,尚未发现有特效药物、有效疫苗或比较好的防治手段去预防或治疗该病,故到目前为止石斑鱼的养殖工作仍然受到很大的阻碍。因此本研究利用转基因微藻混合海水鱼饲料,投喂石斑鱼使其从幼苗阶段就开始获得持续性抗原免疫,来预防病毒性神经坏死病。本研究已从以下方面进行:生物饵料的筛选、纯化、保种、大规模培养;使用电击转化法将pMaa7IR/DGNNVIR表达载体转化入小球藻中,经筛选、DNA鉴定后选出转基因小球藻。先利用转基因小球藻配合海水鱼饲料制作混合饲料投喂石斑鱼,而后进行攻毒实验,并对其预防效果进行评价。研究结果如下:1、采用平板划线法将小球藻保存于固体TAP培养基,并通过逐级扩大培养法进行扩大培养。使用封闭式光生物反应器养殖小球藻,共获得纯净无污染的小球藻液1500L,将生产得到的小球藻用于石斑鱼混合饲料的制作。2、培养纯净无污染的轮虫作为石斑鱼养殖中的生物饵料,从养殖用水盐度、pH、饵料投喂量方面确定了“S”型褶皱臂尾轮虫养殖条件。经本研究结果显示养殖用水盐度20～30时,轮虫种群密度、日平均增殖率达到最大。盐度10～20时,种群密度随盐度升高而增加,当盐度低于10,随盐度降低轮虫增殖效率逐渐下降,盐度低于5轮虫彻底死亡;当pH在7.5～8.5范围时,种群密度、日平均增殖率达到最大值;在盐度、pH、温度等条件适宜情况下,本实验所设置的各个投喂量梯度中维持轮虫培养液中小球藻密度在5×106个/mL以上获得最大种群密度,故得出结论投喂间隔越短、投喂量越大,轮虫种群增长速率越快,最终可以达到的种群密度也会略有上升。3、使用电击转化法将pMaa7IR/DGNNVIR重组载体转入小球藻中,电击条件为:转化电压800V～1600V,脉冲长度032μs,脉冲间隔200ms,脉冲次数90次,电击2～3次;使用10μg/mL巴龙霉素固体TAP培养基进行筛选,并对已筛选过的小球藻进行DNA鉴定,最终获得8株转基因小球藻,对转基因小球藻进行扩大培养,共获得1500L转基因小球藻液。4、将采收的小球藻藻液离心,刮取藻泥,按藻泥:饲料（1:1）比例制作混合饲料,最终制得950g的混合饲料颗粒。使用混合饲料连续投喂石斑鱼,饲养10天后进行攻毒实验。将已经确定病毒拷贝数的病毒提取液（24copies/μL）,使用腹腔注射的方法进行攻毒。攻毒过后从分子水平、细胞学水平、生物学水平进行效果评价。结果显示在攻毒48h后实验组石斑鱼眼、脑组织内病毒含量相比于对照组石斑鱼分别降低了 51.70%、48.47%、53.02%;攻毒48h后取石斑鱼眼、脑组织,制作组织切片可清晰看到鱼眼视网膜、脑组织开始出现空泡化病理变化;攻毒后第2、4、6、10、14天对各组石斑鱼取样测定石斑鱼体内神经坏死病毒拷贝数,结果表明,实验组石斑鱼体内病毒增长趋势、病毒拷贝数要低于对照组;攻毒14天后统计最终成活率。最终成活率:DGNNVRNAi1混合饲料组相较于对照组提高了 26.0%,DGNNVRNAi2混合饲料组相较于对照组提高了 22.0%,DGNNVRNAi3混合饲料组相较于对照组提高了 26.0%。综上所述,经实验结果分析表明转pMaa7IR/DGNNVIR基因小球藻在预防石斑鱼神经坏死病方面有一定作用,可以有效地抑制病毒在石斑鱼体内增殖。
沈海洋,卢志杰,秦真东,赵丽娟,李亚男,刘春,杨光,叶成凯,潘淦,林蠡[3]（2020）在《谷氨酰胺对斜带石斑鱼GF-1细胞中C-Myc蛋白的表达与神经坏死病毒复制的影响》文中研究指明为探讨C-Myc表达、谷氨酰胺代谢和神经坏死病毒复制三者之间的关系,本研究首先克隆了斜带石斑鱼鳍条细胞（GF-1）中的C-Myc基因（GF-1-C-Myc）,结果显示GF-1-CMyc基因cDNA全长814 bp,开放阅读框（ORF）为285 bp,编码95个氨基酸（aa）,有亮氨酸拉链结构域与螺旋-环-螺旋（HLH）结构域。实验表达和纯化了GF-1-C-Myc蛋白,并制备其多克隆抗体。采用实时定量PCR技术（qRT-PCR）与免疫印迹法（WB）检测了GF-1-C-Myc基因的表达和神经坏死病毒的复制。结果显示,缺乏谷氨酰胺会同时抑制GF-1-C-Myc基因的表达和神经坏死病毒（NNV）的复制,添加谷氨酰胺可同时促进GF-1-C-Myc的表达和NNV的复制;此外,NNV感染可上调GF-1-C-Myc基因的表达,并显着消耗GF-1细胞培养液中的谷氨酰胺。研究表明,GF-1-C-Myc基因可调控宿主谷氨酰胺代谢,从而有利于神经坏死病毒的复制。本结果为防控NNV的感染提供了参考。
魏盟智,李亚军,安鑫龙,邓晓东[4]（2020）在《石斑鱼病毒性神经坏死病防治的研究现状》文中进行了进一步梳理主要综述了病毒性神经坏死病的基本特征、诊断技术等研究进展,介绍了神经坏死病毒的防控技术及策略,简单概述了在石斑鱼养殖过程中病毒性神经坏死病的防控工作。
林楠,吴斌,李苗苗,王巧煌,林国清,樊海平,林克冰[5]（2019）在《石斑鱼病毒性神经坏死病的病原分离和鉴定》文中进行了进一步梳理对福建省漳州市某水产养殖场发生的疑似病毒性神经坏死病的病鱼进行病原分离和鉴定.从出现疑似病毒性神经坏死病症状的石斑鱼苗上取眼部、脑部组织进行研磨,将匀浆液接种到条纹月鳢细胞系（SSN）细胞株SSN-1及其克隆细胞株E-11,两株细胞均出现明显的细胞病变,细胞肿胀变圆,呈空泡化并脱落,E-11细胞较SSN-1细胞更早出现细胞病变,且病变更明显.将病鱼眼部、脑部组织的研磨液、细胞培养上清进行RT-PCR检测,均检测出病毒性神经坏死病病毒（VNNV）的特异性条带,目的片段大小为427 bp,序列比对结果提示该病原为赤点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV）.电镜观察结果显示,细胞培养上清中存在直径约30 nm的病毒颗粒,细胞质内大量病毒颗粒聚集成团,细胞器受损,细胞结构被破坏.将分离得到的VNNV进行温度、酸碱度敏感性试验,结果显示:50℃下处理30 min后该病毒滴度明显下降,60℃处理30 min后病毒失活;在pH为3、11的条件下病毒滴度均明显下降.
刘瑞婷[6]（2019）在《太平洋鳕Fas/FasL基因的克隆与功能研究》文中提出太平洋鳕神经坏死病毒（Pacific cod nervous necrosis virus,PCNNV）是太平洋鳕繁育过程中易感染并导致鱼苗大量死亡的主要病毒。本研究从太平洋鳕中克隆获得Fas和FasL基因,对其进行生物信息学分析、原核表达、亚细胞定位以及对EPC细胞系的效应等研究,以期从FasL/Fas信号通路探索PCNNV暴发时太平洋鳕的免疫调节机制,为实现太平洋鳕的人工繁育提供理论依据。太平洋鳕FasL cDNA长1388 bp,5′UTR占315 bp,3′UTR占500 bp,ORF含有573 bp,ORF编码190个氨基酸,预测的编码蛋白含有一个较为保守的TNF家族同源结构域（THD）。构建了pET-32a-FasL原核表达载体,体外获得蛋白分子量约为39 kDa的FasL重组蛋白,蛋白质谱鉴定结果与预期氨基酸序列一致。MTT法检测FasL重组蛋白对EPC细胞系的效应,结果显示,高浓度的FasL重组蛋白可诱导EPC细胞大量死亡。Fas是FasL的受体,太平洋鳕Fas基因cDNA全长1975bp,5′UTR占106 bp,3′UTR占867 bp,ORF含有1002 bp,ORF编码333个氨基酸,预测的编码蛋白含有一个信号肽、一个跨膜区、3个CRD结构域和1个DD结构域。系统进化树分析结果显示,Fas和FasL的进化方向与物种进化的方向一致,且功能结构域的保守性较高。QPCR结果表明,Fas和FasL可在多个组织中表达,且在脾和鳃中的表达量较高;Fas和FasL在太平洋鳕仔鱼发育过程中的表达不同步;PCNNV感染后,Fas基因表达水平会出现显着上调,但高拷贝的病毒会抑制FasL的表达。本研究分别构建了Fas和FasL的真核表达载体GFP-Fas、pDsRed-FasL。亚细胞定位显示,FasL主要定位在细胞质中,Fas主要以星状定位于细胞膜。MTT法检测FasL重组蛋白和Fas过表达对EPC细胞系的协同效应,结果显示,Fas的过表达可提高FasL重组蛋白诱导的细胞死亡率。经qPCR检测发现,Fas的过表达可以显着诱导Fas/FasL信号通路中bcl-2、bax、RIP3、MLKL、PGAM基因的上调,对caspase3、caspase9基因的诱导不显着,FasL的过表达可以显着诱导Fas/FasL信号通路中bax、caspase3、caspase9、RIP3、MLKL基因的上调,但PGAM基因下调。流式细胞术检测结果显示,Fas过表达会诱导EPC细胞发生细胞凋亡和坏死;FasL过表达会导致EPC细胞发生凋亡。该结果与Fas/FasL信号通路相关基因的转录水平相符。
郭德权[7]（2019）在《转NNVCP基因衣藻预防石斑鱼病毒性神经坏死病》文中认为石斑鱼是一种含有高蛋白、低脂肪的上等食用鱼,是我国人工养殖的重要经济鱼类。其中,石斑鱼的主要养殖品种是珍珠龙胆石斑鱼。珍珠龙胆石斑鱼常因感染鱼类病毒性神经坏死病（viral nervous necrosis,VNN）而损失惨重。VNN是养殖鱼类的常发病,其危害大,死亡率高达65-100%。隶属于罗达病毒科（Nodaviridae）,目前认为其有四种基因型。通过病毒血清型研究表明,4种基因型外壳蛋白的254～256位氨基酸为主要抗原决定簇,说明外壳蛋白基因可以用作抗原基因。目前,由于没有特效疫苗和特异药物防治石斑鱼病毒性神经坏死病,所以石斑鱼苗养殖受到VNN的严重制约。而微藻能进行光合作用,是最原始的初级生产者成员,也在水产养殖中有巨大作用,特别在水产动物的小苗阶段。衣藻（Chlamydomonas）生长周期短、是水体中常见优势藻类,适生性强,是幼鱼的天然饵料。而外壳蛋白含抗原决定簇,可以作为抗原在饵料微藻中表达,得到抗原蛋白,使得饲喂了转病毒性神经坏死病病毒外壳蛋白（NNVCP）基因衣藻的石斑鱼持续获得抗原免疫。因此,采用转NNVCP基因衣藻来预防VNN具有广阔的应用前景。本论文从以下方面进行研究:经济藻株的保种、分离纯化和扩培;构建pCAMBIA1302-NNVCP重组载体;将重组载体采用玻璃珠转化法转入莱茵衣藻;并进行不同种类,不同浓度的抗性筛选;随后对筛选的藻株进行DNA、RNA水平验证;收集海南省乐东县某石斑鱼养殖基地培育的珍珠龙胆石斑鱼发病鱼苗,对其初步确诊断为VNN;采用转基因微藻混合饲料进行预防石斑鱼VNN实验,其研究结果如下:1、经济藻株的保种、分离、纯化和扩培对六种经济藻株的液态不纯藻株采用稀释分离法进行分离,成功分离纯化出六种经济藻株液态纯种;采用10、20、40、60、80、100 μg/ml浓度的氨苄青霉素,对其采用平板划线法,成功在固体培养基上纯化出盐藻、海水小球藻、扁藻。并将纯化的藻种分别用对应的培养基进行保种。采用逐步放大培养法,对3种经济藻株进行液态扩培,每次扩培终体积为100 L,期间总共扩培5次,总共扩培经济藻株体积500L。本实验不仅增加了实验室藻株资源库的种类,扩培的藻株用于苗种企业生产实践,实现了产研学的价值。2、重组载体的构建、转化衣藻及筛选通过NCBI查找NNVCP基因与pCAMBIA1302载体重组,成功构建表达载体pCAMBIA1302-NNVCP。并将pCAMBIA1302-NNVCP真核表达载体转入衣藻。对pCAMBIA1302-NNVCP转基因藻株进行抗性筛选。结果显示:pCAMBIA1302-NNVCP转基因藻株分别通过含有潮霉素2、5、10、15 μg/ml TAP固体培养基进行筛选,筛选成功的藻株有42株,最终接种在含有10μg/ml潮霉素的固体TAP培养基。3、转基因藻株的鉴定、保种、扩培和采收对抗性筛选后的转基因藻株进行鉴定,对其进行DNA、RNA提取,并进行PCR验证。结果显示:在pCAMBIA1302-NNVCP藻株中,有26株呈阳性。将得到的26株转基因藻株保种在含有对应抗生素的平板培养基,并进行转基因藻液态扩培,扩培出pCAMBIA1302-NNVCP-14/15/16藻液质量分别为60.2g、66.7g、69.2g、65.7g,为转基因微藻预防石斑鱼VNN提供实验材料。4、海南珍珠龙胆石斑鱼苗VNN的初步诊断收集海南省乐东县某石斑鱼养殖基地培育的珍珠龙胆石斑鱼发病鱼苗。通过诊断,结果显示:出现了典型VNN症状,对患病鱼体进行了寄生虫学检查,结果为阴性;采用RT-PCR方法、采用OIE推荐引物,VNN的PCR产物特异性片段大小为421 bp;采用细胞肿大病毒、虹彩病毒检测引物,采用RT-PCR方法排除混合感染,以此初步诊断为VNN。在此之前,很少有报道VNN在冬季发生,因此本研究对深入探索VNN具有重要意义,并且为攻毒实验提供材料。5、转基因微藻预防珍珠龙胆石斑鱼VNN实验探究出两种简易自制转基因工程微藻混合饲料的制作方法。连续十天喂食转基因混合饲料后,进行攻毒实验。从分子水平、细胞学水平、生物学水平结果显示:攻毒24小时后实验组脑组织中VNN病毒外壳蛋白mRNA含量比饲料对照组分别下降了67.25%、36.61%、77.17%;攻毒24小时实验组脑组织空泡化数量比对照组少,空泡化病变比对照组轻微;实验组平均存活率比饲料对照组高出33.33%,表明转NNVCP基因衣藻对预防石斑鱼病毒性神经坏死病有一定的作用。
伊丽竹[8]（2018）在《抗鱼类神经坏死病毒和抗嗜水气单胞菌卵黄抗体的制备及特性分析》文中研究表明神经坏死病毒（nervous necrosis virus,NNV）是病毒性神经坏死症（viral nervous necrosis,VNN）的主要传染病原,感染全球多种海水和淡水鱼类,在鱼苗期的致死率可达100%,严重制约着全世界的鱼类养殖业的健康发展。由于鱼苗特异性免疫系统发育不全,目前对于感染NNV的幼鱼尚无有效的病毒防治措施。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是引起鱼类细菌性败血症的主要致病菌。淡水鱼类细菌性败血症在我国是水产养殖过程中危害鱼类的种类最多、流行水域最广的一种急性传染病。由于抗生素的滥用导致大量耐药菌株的发生,研发新的防治手段刻不容缓。卵黄免疫球蛋白（Immunoglobulin of yolk,IgY）来源于卵生动物,经血清转移并富集至卵黄中,具有产量高、成本低和理化性质稳定的特点,广泛应用于被动免疫,尤其是免疫系统尚未发育完全的幼仔。本研究制备了两种特异性病原卵黄抗体。我们克隆并表达了赤点石斑神经坏死病毒（Red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV）的重组衣壳蛋白,并将其作为抗原免疫产蛋母鸡制备特异性抗RGNNV的卵黄抗体。同时将灭活的嗜水气单胞菌免疫母鸡以制备抗嗜水气单胞菌卵黄抗体。开展了卵黄抗体的稳定性和免疫保护实验。主要结果如下:1.卵黄抗体的制备和效价。采用水稀释法分离鸡蛋中的卵黄抗体,两步硫酸铵盐析法进行纯化。ELISA检测显示首次免疫后第六周抗RGNNV卵黄抗体效价达到最高值。最高效价可达1:51200,而抗嗜水气单胞菌卵黄抗体于首次免疫后第七周效价达到最高值,效价为1:25600。两种卵黄抗体均可持续保持高效价数周。2.卵黄抗体的稳定性。抗RGNNV卵黄抗体在70℃以下、pH=2-10、及胃蛋白酶消化（pH=3-10）的条件下可以保持相对稳定的活性。抗嗜水气单胞菌卵黄抗体在60℃以下及pH值高于4时其活性稳定性较高。经30-60℃加热处理或pH（2-10）处理及胃蛋白酶消化（pH=3-10）的抗RGNNV卵黄抗体仍可以完全抑制RGNNV在GF-1细胞中增殖,但在pH=2的环境下胃蛋白酶消化处理的特异性卵黄抗体与病毒的中和能力有所减弱。证明卵黄抗体具有较稳定的耐高温、耐酸碱、耐胃蛋白酶消化的特点。3.抗RGNNV卵黄抗体的免疫保护作用。Western blot结果显示抗RGNNV卵黄抗体具有较强的特异性和亲和力,能够有效识别RGNNV衣壳蛋白。特异性抗RGNNV卵黄抗体能有效地中和RGNNV,抑制病毒在石斑鱼鳍条细胞（Grouper fin cell line,GF-1）中的复制,保护GF-1细胞免受病毒感染,表明特异性抗RGNNV卵黄抗体能有效防止RGNNV在细胞中的感染。4.抗嗜水气单胞菌卵黄抗体的免疫保护作用。在使用嗜水气单胞菌攻毒团头鲂前24 h注射特异性卵黄抗体,攻毒一周后存活率为60%;而注射非特异性卵黄抗体组和不注射卵黄抗体组的存活率仅10%。使用嗜水气单胞菌攻毒团头鲂后12 h注射特异性卵黄抗体,攻毒一周后存活率为50%,注射非特异性卵黄抗体和不注射卵黄抗体的实验组的死亡率为100%。这些免疫保护结果和组织病理切片结果一致。表明抗嗜水气单胞菌卵黄抗体有显着的预防和治疗嗜水气单胞菌感染的效果。
陈文捷[9]（2017）在《赤点石斑神经坏死病毒感染GF-1和SSN-1细胞的microRNA组与转录组研究》文中指出鱼类神经坏死病毒（Nervous necrosis virus,NNV）也称为β野田病毒（betanodavirus）,是野田病毒（Nodaviridae）家族的一员。NNV感染导致的疾病称为病毒性神经坏死症（viral nervous necrosis,VNN）或者病毒性脑病和视网膜病（viral encephalopathy and retinopathy,VER）,最初分离自患病的海洋鱼类,现在已在120多种不同的养殖和野生鱼类中被报道,严重危害着水产养殖业。近年来,越来越多的证据表明NNV开始在淡水鱼类中流行,感染实验也表明很多淡水鱼类容易受到NNV感染。虽然各国学者在NNV感染的预防和治疗方面投入了大量的研究,但对NNV致病的分子机制还没有完全阐明。通过研究赤点石斑神经坏死病毒（Red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV）感染敏感细胞系的microRNA（miRNA）表达谱和转录组测序,可以获得大量RGNNV和宿主相互作用的信息,这些结果将有助于了解RGNNV的复制和致病机制,进而为VER的综合防控提供新的策略。虽然目前已经建立了一些对NNV敏感的细胞系,但来自鱼类神经组织的敏感细胞系还很少,因此,寻找来自鱼类神经组织的NNV敏感细胞系是十分必要的。本研究首先以斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）鳍条细胞系（Grouper fin cells,GF-1）为对象,利用RNA-Seq技术（Illumina）测定了GF-1细胞在RGNNV感染后3和24小时（hour,h）的miRNA表达谱。随后分别研究了GF-1细胞和来自纹月鳢（Channa striatus）鱼苗的SSN-1细胞（striped snakehead fish cells）在RGNNV感染后3和24 h的转录组,在转录组分析的基础上,进一步对NNV感染导致的细胞凋亡途径进行分析,并对两个转录组进行了比较研究。我们还采用鳜脑细胞（Chinese perch brain,CPB）,研究了CPB对RGNNV的敏感性,并在此基础上研究了鳜对RGNNV的敏感性。研究结果如下:1.通过solexa深度测序研究RGNNV感染后GF-1细胞的miRNA表达谱,利用miRDeep2 v2.0.5软件将测序结果与斑马鱼基因组比对,一共鉴定出了220种已知miRNA,预测了18种新的miRNA。利用IDEG 6软件,分别在RGNNV感染后3和24 h的GF-1细胞中鉴定到了51和16种差异表达的miRNA（Differentially expressed miRNA,DE-miRNA）;对DE-miRNA的靶基因进行预测、功能注释及分析,这些靶基因与广泛的生理调控有关,如转录调控、氧化还原、蛋白水解、细胞凋亡和免疫应答等。通过随机挑选了6个新预测的miRNA进行RT-PCR验证,结果表明这些新的miRNA在GF-1细胞中能够表达。通过随机挑选了6个DE-miRNA进行qRT-PCR验证,这些DE-mi RNA的表达趋势与测序结果一致,表明miRNA组测序结果可信;验证了4个DE-miRNA（miR-1,-30b,-150,-184）对RGNNV复制的影响,qRT-PCR和Western blot表明过表达这四种miRNA可以显着地促进RGNNV在GF-1细胞中的复制。2.通过HiSeq 2500测序,一共从四个GF-1细胞样品中获得127,259,258 clean reads,经De novo拼接一共获得了111,860条平均长度为624 bp的unigene;通过blast比对,一共有35,390 unigene（31.64%）得到注释。差异表达基因（Differentially expressed gene,DEG）筛选表明,感染后3和24 h分别有226和117个DEG。进一步对凋亡通路的DEG进行分析,推测RGNNV诱导GF-1细胞的凋亡可以通过线粒体凋亡途径中的Bax和Drp1蛋白来进行;对5个随机挑选的DEG的进行qRT-PCR验证,结果与HiSeq 2500测序的结果一致,证实转录组结果是可信的;通过发光法检测Caspase-3,-8和-9的活性,结果表明RGNNV感染可以导致GF-1细胞中Caspase-3,-8,-9活性的显着升高。3.经HiSeq 2000测序,一共从四个SSN-1细胞样品中获得253,338,544 clean reads,经De novo拼接一共获得了93,372条平均长度为829 bp的unigene。通过blast比对,一共有18,974 unigene（20.32%）得到注释。DEG筛选表明,感染后3和24 h分别有2,640和3,211个DEG;对凋亡通路的DEG进行分析,结果表明RGNNV诱导SSN-1细胞的凋亡可以通过线粒体凋亡途径中的EndoG蛋白来进行;对7个随机挑选的DEG的进行qRT-PCR验证,与转录组测定的结果相符,表明测序结果是可信的;通过Annexin V-FITC/PI和DAPI染色,证实RGNNV感染或过表达EndoG可以导致SSN-1细胞的凋亡。4.比较RGNNV诱导GF-1和SSN-1细胞凋亡的途径,在RGNNV感染GF-1和SSN-1细胞的转录组研究中,外源性凋亡途径相关基因的表达都没有发生显着的上调。在内源性凋亡途径方面,RGNNV感染后GF-1细胞中Bax以及Drp1的表达水平显着升高,而SSN-1细胞在RGNNV感染后,EndoG的表达水平显着升高,这三种蛋白都参与线粒体介导的细胞凋亡。此外,在内质网（Endoplasmic reticulum,ER）应激反应方面,RGNNV感染后,Bip的表达水平在GF-1和SSN-1细胞中都发生了显着上调,最终导致线粒体介导的细胞凋亡。由此我们推测RGNNV感染可以通过线粒体和内质网介导的凋亡途径来诱导细胞凋亡,具体的机制还需要进一步研究。5.评估了来自淡水鱼类鳜脑组织的细胞系CPB对RGNNV的敏感性。qRT-PCR检测表明RGNNV在CPB细胞中可以良好地复制。Annexin V-FITC/PI和DAPI两种染色途径证实RGNNV感染可以导致CPB细胞的凋亡。进一步评估鳜对RGNNV的敏感性,通过眼球注射,RGNNV可以感染鳜并导致鳜出现神经症状,表现为游泳异常;对鳜脑组织进行苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色观察,感染的鳜脑组织出现大量的细胞空泡化;电镜（electronic microscope,EM）扫描发现在感染的鳜脑组织里有大量紧密排列的病毒粒子,并且大量线粒体出现了肿胀,这一现象与线粒体膜电位损失是否有关还需要进一步的研究。对RGNNV敏感的淡水鱼类脑细胞株CPB的发现,将为RGNNV的致病性研究提供有力的工具。
陈文捷,刘晓丹,胡先勤,王文文,秦真东,王瑶,周洋,刘小玲,林蠡[10]（2014）在《鱼类神经坏死病毒研究进展与发展趋势》文中研究表明神经坏死病毒（nervous necrosis virus,NNV）是一种世界范围内流行、严重危害多种海水和淡水鱼类的传染性病原。NNV为单一正链、2节段RNA病毒,基因组由RNA1（3.1 kb）和RNA2（1.4 kb）组成。在病毒复制过程中,会合成亚基因组RNA3。RNA1编码RNA聚合酶。RNA2编码衣壳蛋白,为病毒的唯一结构蛋白。RNA3编码B1和B2两种非结构蛋白。根据病毒衣壳蛋白的基因序列,神经坏死病毒可以分成4种基因型,分别为拟鲹、红鳍东方鲀、条斑星鲽和赤点石斑神经坏死病毒基因型。但是,目前只发现A、B、C三种病毒血清型,A对应拟鲹神经坏死病毒基因型,B对应红鳍东方鲀神经坏死病毒基因型、C对应条斑星鲽神经坏死病毒和赤点石斑神经坏死病毒基因型。病毒存在垂直和水平两种传播途径,而且广泛分布于养殖和野生鱼类中。阻断病毒在野生与养殖鱼类之间的传播和开展新型鱼类疫苗研发是将来研究趋势。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 1 神经坏死病毒(nervous necrosis virus, NNV)概述 |
| 2 神经坏死病毒的致病机理研究现状 |
| 2.1 NNV的附着 |
| 2.2 NNV致病的决定区 |
| 2.3 NNV引起的细胞凋亡 |
| 2.3.1 线粒体介导的细胞凋亡 |
| 2.3.2 内质网介导的细胞凋亡 |
| 2.3.3 抑制细胞凋亡的机制 |
| 2.4 NNV的免疫逃避机制 |
| 3 展望 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 1.1 病毒性神经坏死病研究现状 |
| 1.1.1 石斑鱼病毒性神经坏死病概述 |
| 1.1.2 病毒性神经坏死病的临床症状 |
| 1.1.3 病毒性神经坏死病的传播途径 |
| 1.1.4 病毒性神经坏死病的地理分布 |
| 1.1.5 病毒性神经坏死病的防控 |
| 1.1.6 病毒性神经坏死病的检测与诊断技术 |
| 1.2 微藻的应用现状 |
| 1.2.1 微藻概述 |
| 1.2.2 微藻的应用 |
| 1.3 褶皱臂尾轮虫的应用现状 |
| 1.3.1 褶皱臂尾轮虫介绍 |
| 1.3.2 褶皱臂尾轮虫的应用 |
| 1.4 本实验的目的、意义与技术路线 |
| 1.4.1 实验研究的目的与意义 |
| 1.4.2 实验技术路线 |
| 2. 微藻的保种和扩大培养 |
| 2.1 实验材料、试剂及仪器 |
| 2.1.1 实验材料及仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 藻种的保存 |
| 2.2.2 微藻的扩大培养 |
| 2.2.3 两种生物反应器培养藻类对比 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3. 轮虫的培养 |
| 3.1 实验材料、试剂及仪器 |
| 3.1.1 实验材料及仪器 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 测定pH对褶皱臂尾轮虫影响的方法 |
| 3.2.2 测定盐度对褶皱臂尾轮虫影响的方法 |
| 3.2.3 测定投喂间隔对褶皱臂尾轮虫影响的方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 pH对褶皱臂尾轮虫生长的影响 |
| 3.3.2 盐度对褶皱臂尾轮虫的影响 |
| 3.3.3 投喂间隔对褶皱臂尾轮虫的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4. 转化小球藻(HOC5)及鉴定 |
| 4.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器及试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 pMaa7IR/DGNNVIR表达载体转化小球藻HOC5 |
| 4.2.2 转基因小球藻的鉴定 |
| 4.2.3 转pMaa7IR/DGNNVIR小球藻的基因相对表达量测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 电击法转化小球藻HOC5及筛选 |
| 4.3.2 小球藻藻株转化子DNA检测 |
| 4.3.3 转DGNNVRNAi载体小球藻的基因相对表达量 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5. 转基因小球藻的保种、扩培以及混合饲料的制作 |
| 5.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器及试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 转基因小球藻的保种 |
| 5.2.2 藻株的扩大培养及收集 |
| 5.2.3 转基因小球藻混合饲料的制作 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6. 石斑鱼病毒性神经坏死病的诊断 |
| 6.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器及试剂 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 发病情况调查 |
| 6.2.2 寄生虫病检查 |
| 6.2.3 细菌、真菌性传染病检查 |
| 6.2.4 病毒性疾病检查 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7. 转基因小球藻预防石斑鱼病毒性神经坏死病实验 |
| 7.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验仪器及试剂 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 转基因小球藻混合饲料投喂石斑鱼 |
| 7.2.2 神经坏死病毒提取液滴度的测定 |
| 7.2.3 攻毒石斑鱼试验 |
| 7.2.4 转基因小球藻预防VNN效果评价 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 转基因小球藻投喂石斑鱼 |
| 7.3.2 最佳注射神经坏死病毒提取液滴度的确定 |
| 7.3.3 攻毒石斑鱼结果 |
| 7.3.4 转基因小球藻预防石斑鱼VNN效果评价 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 8. 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 1 我国石斑鱼养殖和神经坏死病发病现状 |
| 2 神经坏死病毒 |
| 3 检测、诊断技术 |
| 3.1 表型观察 |
| 3.2 免疫学诊断技术 |
| 3.3 分子生物学检测技术 |
| 4 病毒传播途径 |
| 5 防治途径 |
| 5.1 物理防控 |
| 5.2 免疫防控 |
| 6 展望 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 仪器与设备 |
| 1.2 病鱼材料的提取 |
| 1.3 细胞培养 |
| 1.4 病毒分离 |
| 1.4.1 病鱼材料的处理 |
| 1.4.2 细胞悬液的收集 |
| 1.5 RT-PCR鉴定 |
| 1.5.1 引物合成 |
| 1.5.2 病毒核酸的提取 |
| 1.5.3 RT-PCR鉴定 |
| 1.5.4 产物检测 |
| 1.5.5 序列比对及系统树的构建 |
| 1.6 电镜观察 |
| 1.6.1 病毒颗粒负染观察 |
| 1.6.2 细胞超薄切片的观察 |
| 1.7 病毒特性分析 |
| 1.7.1 病毒滴度的测定 |
| 1.7.2 温度敏感性试验 |
| 1.7.3 酸碱度敏感性试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 发病鱼的临床症状 |
| 2.2 病毒的细胞分离 |
| 2.3 病毒的RT-PCR鉴定 |
| 2.4 病毒的电镜观察 |
| 2.5 病毒滴度 |
| 2.6 病毒的温度敏感性 |
| 2.7 病毒的酸碱度敏感性 |
| 3 讨论 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1 太平洋鳕研究综述 |
| 1.1 太平洋鳕的捕捞和养殖现状 |
| 1.2 鱼类神经坏死病毒 |
| 2 鱼类Fas和 FasL的研究现状 |
| 2.1 Fas/FasL的结构与功能 |
| 2.2 Fas/FasL与病毒的关系 |
| 2.3 Fas/FasL在鱼类中的研究进展 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 太平洋鳕Fas和 FasL基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器和设备 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 总RNA提取 |
| 2.2 反转录 |
| 2.3 太平洋鳕Fas和 FasL基因的PCR扩增 |
| 2.4 PCR产物的纯化与回收 |
| 2.5 PCR产物与载体的连接与转化 |
| 2.6 阳性克隆序列鉴定 |
| 2.7 生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 总RNA提取 |
| 3.2 Fas和 FasL的克隆及生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 Fas与 FasL表达模式及对NNV的响应 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 总RNA提取 |
| 2.2 反转录 |
| 2.3 Fas和 FasL相对荧光定量分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Fas/FasL的组织差异表达 |
| 3.2 发育早期Fas/FasL表达规律 |
| 3.3 Fas/FasL对 NNV的响应 |
| 4 讨论 |
| 第四章 FasL原核表达载体构建、条件优化及蛋白纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂及菌株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 FasL原核表达 |
| 2.2 FasL重组蛋白表达条件优化 |
| 2.3 FasL重组蛋白可溶性分析及纯化 |
| 3 实验结果及分析 |
| 3.1 重组载体构建与鉴定 |
| 3.2 重组蛋白的诱导表达与鉴定 |
| 3.3 融合蛋白的纯化 |
| 4 讨论 |
| 第五章 Fas和 FasL对 EPC的效应分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂及细胞 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 EPC培养 |
| 2.2 Fas和 FasL真核表达载体构建 |
| 2.3 去内毒素质粒提取 |
| 2.4 亚细胞定位 |
| 2.5 FasL重组蛋白对EPC的细胞效应 |
| 2.6 Fas过表达和重组蛋白FasL协同作用下的细胞效应 |
| 2.7 Fas和 FasL过表达时凋亡/坏死相关基因的表达规律 |
| 2.8 流式细胞术检测Fas和 FasL过表达时的细胞效应 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 载体构建 |
| 3.2 Fas/FasL的亚细胞定位 |
| 3.3 FasL重组蛋白对EPC的细胞效应 |
| 3.4 Fas过表达和FasL重组蛋白协同作用下的细胞效应 |
| 3.5 Fas和 FasL过表达时凋亡/坏死相关基因的表达规律 |
| 3.6 流式细胞术检测Fas和 FasL过表达时的细胞效应 |
| 4 讨论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表论文目录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 鱼类病毒性神经坏死病(VNN)的研究进展 |
| 1.1.1 鱼类病毒性神经坏死病(VNN)的发现、命名及分类 |
| 1.1.2 VNN的地理分布、结构、理化性质 |
| 1.1.3 VNN的传播途径及危害 |
| 1.1.4 VNN的检测方法及防治 |
| 1.2 微藻的应用前景 |
| 1.3 研究的意义及技术路线 |
| 1.3.1 研究的目的意义 |
| 1.3.2 研究的技术路线 |
| 2. 经济藻株的保种、分离纯化和扩培 |
| 2.1 实验材料、仪器和试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器、试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 藻类的保种 |
| 2.2.2 藻类的分离 |
| 2.2.3 藻类的纯化 |
| 2.2.4 藻类的扩培 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 小结 |
| 3. 重组载体的构建 |
| 3.1 实验材料、仪器和试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器、试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 NNVCP基因的引物设计 |
| 3.2.2 构建pCAMBIA1302-NNVCP重组载体 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 小结 |
| 4. 细胞核表达载体转化莱茵衣藻CC425及鉴定 |
| 4.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器、试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 pCAMBIA1302-NNVCP载体转化莱茵衣藻CC425 |
| 4.2.2 转基因藻株的DNA的鉴定（李亚军等,2014;高寒等,2016) |
| 4.2.3 转基因藻株的RNA的鉴定 |
| 4.2.4 转基因藻株的RT-PCR |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 小结 |
| 5. 转基因藻株的保种、扩培和采收 |
| 5.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器、试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 转基因藻株的保种 |
| 5.2.2 转基因藻株的液态扩大培养 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 小结 |
| 6.海南石斑鱼苗病毒性神经坏死病的诊断 |
| 6.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器、试剂 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 发病情况的调查 |
| 6.2.2 实验室检查 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.4 小结 |
| 7. 转NNVCP基因衣藻预防珍珠龙胆石斑鱼VNN实验 |
| 7.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验仪器、试剂 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 转基因微藻混合饲料的制作 |
| 7.2.2 微藻混合饲喂石斑鱼 |
| 7.2.3 最佳麻醉浓的确定 |
| 7.2.4 NNV攻毒石斑鱼 |
| 7.2.5 转基因微藻防治VNN效果评价 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.4 小结 |
| 8. 讨论与结论 |
| 8.1 讨论 |
| 8.1.1 藻株的分离方法和培养方式 |
| 8.1.2 莱茵衣藻 |
| 8.1.3 转NNVCP基因衣藻预防珍珠龙胆石斑鱼的成效 |
| 8.2 展望 |
| 8.3 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 缩略词 |
| 2 部分实验操作步骤 |
| 2.1 从大肠杆菌中抽提质粒（上海生工） |
| 2.2 组织病理切片制作的主要步骤（徕创生物） |
| 2.3 E.coli DH5a感受态细胞的制备 |
| 2.4 病毒DNA提取步骤 |
| 2.5 病毒RNA提取步骤 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 前言 |
| 1.1 神经坏死病毒研究进展 |
| 1.1.1 NNV概述 |
| 1.1.2 NNV的分类与分布 |
| 1.1.3 NNV的基因组结构及其功能 |
| 1.1.4 NNV的诊断方法 |
| 1.1.5 NNV的传播与防治 |
| 1.2 嗜水气单胞菌研究进展 |
| 1.2.1 嗜水气单胞菌概述 |
| 1.2.2 嗜水气单胞菌致病性 |
| 1.2.3 嗜水气单胞菌的防治 |
| 1.3 卵黄抗体研究进展 |
| 1.3.1 卵黄抗体的研究历史 |
| 1.3.2 卵黄抗体的结构 |
| 1.3.3 卵黄抗体的生物学特性 |
| 1.3.4 卵黄抗体的提取纯化方法 |
| 1.3.5 卵黄抗体在水产疾病防治中的应用 |
| 1.4 本研究目的和意义 |
| 2 抗鱼类神经坏死病毒卵黄抗体的制备及其特性研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物与饲料 |
| 2.1.2 细胞与病毒 |
| 2.1.3 主要试剂及仪器 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 GF-1细胞的培养和感染 |
| 2.2.2 总RNA的提取 |
| 2.2.3 构建衣壳蛋白重组质粒 |
| 2.2.4 衣壳蛋白表达条件的摸索 |
| 2.2.5 GST融合蛋白的纯化 |
| 2.2.6 母鸡的免疫 |
| 2.2.7 卵黄抗体的纯化 |
| 2.2.8 抗神经坏死病毒卵黄抗体的效价检测 |
| 2.2.9 抗神经坏死病毒卵黄抗体特异性检测 |
| 2.2.10 抗神经坏死病毒卵黄抗体的免疫保护效果评估 |
| 2.2.11 抗神经坏死病毒卵黄抗体稳定性检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 神经坏死病毒衣壳蛋白基因的克隆及表达 |
| 2.3.2 卵黄抗体的纯化 |
| 2.3.3 抗神经坏死病毒卵黄抗体的效价和特异性检测 |
| 2.3.4 抗神经坏死病毒卵黄抗体的免疫保护作用 |
| 2.3.5 抗神经坏死病毒卵黄抗体的稳定性实验 |
| 2.4 讨论 |
| 3 抗嗜水气单胞菌卵黄抗体的制备及特性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 嗜水气单胞菌灭活疫苗的制备 |
| 3.2.2 抗嗜水气单胞菌卵黄抗体的制备 |
| 3.2.3 抗嗜水气单胞菌卵黄抗体的效价检测 |
| 3.2.4 抗嗜水气单胞菌卵黄抗体稳定性检测 |
| 3.2.5 组织病理学观察 |
| 3.2.6 抗嗜水气单胞菌卵黄抗体的免疫保护与治疗 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 抗嗜水气单胞菌卵黄抗体的效价检测 |
| 3.3.2 抗嗜水气单胞菌卵黄抗体的稳定性检测 |
| 3.3.3 抗嗜水气单胞菌卵黄抗体的免疫保护和治疗作用 |
| 3.4 讨论 |
| 4 结论及不足之处 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 创新之处 |
| 4.3 不足之处 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 (Abbreviation) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 NNV的研究历史 |
| 1.2 NNV的命名、分类和分布 |
| 1.3 NNV的基因组结构特征 |
| 1.4 NNV编码的蛋白与主要功能 |
| 1.4.1 RNA聚合酶 |
| 1.4.2 B1蛋白 |
| 1.4.3 B2蛋白 |
| 1.4.4 衣壳蛋白 |
| 1.5 NNV的检测、流行病学和感染模式的建立 |
| 1.6 高通量测序技术在水产动物病毒研究中的应用 |
| 1.6.1 转录组测序技术 |
| 1.6.2 小RNA深度测序技术 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 第二章 RGNNV感染GF-1 细胞的microRNA表达谱研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 GF-1 细胞的培养 |
| 2.1.5 细胞样品的收集 |
| 2.1.6 总RNA提取 |
| 2.1.7 总RNA样品质量检测 |
| 2.1.8 solexa高通量测序 |
| 2.1.9 测序数据处理与分析 |
| 2.1.10 qRT-PCR验证差异表达miRNA |
| 2.1.11 RT-PCR和qRT-PCR检测novel miRNA |
| 2.1.12 miRNA mimic转染 |
| 2.1.13 病毒基因的qRT-PCR检测 |
| 2.1.14 病毒基因的Western blot检测 |
| 2.1.15 统计学方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RNA样品的提取和质量鉴定 |
| 2.2.2 测序质量分析与产量统计 |
| 2.2.3 小RNA长度分布 |
| 2.2.4 小RNA分类统计 |
| 2.2.5 与斑马鱼基因组比对结果 |
| 2.2.6 已知miRNA的鉴定和新miRNA的预测 |
| 2.2.7 miRNA家族分析 |
| 2.2.8 miRNA表达量分析 |
| 2.2.9 miRNA差异表达分析 |
| 2.2.10 RT-PCR和qRT-PCR验证测序结果 |
| 2.2.11 miRNA靶基因预测及注释 |
| 2.2.12 差异表达miRNA靶基因GO及KEGG富集分析 |
| 2.2.13 参与宿主免疫调控的miRNA潜在靶基因分析 |
| 2.2.14 转染miRNA mimic对RGNNV复制影响的初步研究 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 RGNNV感染GF-1 细胞的转录组研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒与细胞 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.1.4 GF-1 细胞的培养 |
| 3.1.5 细胞样品的收集 |
| 3.1.6 总RNA提取 |
| 3.1.7 总RNA样品质量检测 |
| 3.1.8 solexa高通量测序 |
| 3.1.9 测序数据处理与分析 |
| 3.1.10 Caspase-3，-8，-9 活性检测 |
| 3.1.11 统计学方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RNA样品质量检测 |
| 3.2.2 测序产量统计与质量分析 |
| 3.2.3 转录组测序文库质量评估 |
| 3.2.4 De novo序列组装结果 |
| 3.2.5 Unigene功能注释 |
| 3.2.6 Unigene表达量分析 |
| 3.2.7 差异表达基因 (DEG) 筛选 |
| 3.2.8 差异表达基因 (DEG) 功能注释 |
| 3.2.9 凋亡通路相关的unigene分析以及qRT-PCR验证 |
| 3.2.10 Caspase-3，-8，-9 活性检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 RGNNV感染SSN-1 细胞的转录组研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒与细胞 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.1.4 SSN-1 细胞的培养 |
| 4.1.5 细胞样品的收集 |
| 4.1.6 总RNA提取 |
| 4.1.7 总RNA样品质量检测 |
| 4.1.8 solexa高通量测序 |
| 4.1.9 测序数据处理与分析 |
| 4.1.10 SSN-EndoG序列特征和进化分析 |
| 4.1.11 SSN-EndoG的克隆、重组质粒的构建及转染 |
| 4.1.12 RGNNV感染或过表达EndoG诱导SSN-1 细胞凋亡的观察 |
| 4.1.13 免疫荧光检测EndoG在SSN-1 细胞中的表达 |
| 4.1.14 统计学方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 RNA样品质量检测 |
| 4.2.2 测序产量统计与质量分析 |
| 4.2.3 De novo序列组装结果 |
| 4.2.4 Unigene功能注释 |
| 4.2.5 差异表达基因 (DEG) 筛选 |
| 4.2.6 差异表达基因的GO功能分类 |
| 4.2.7 差异表达基因的KEGG通路分析 |
| 4.2.8 与凋亡通路有关的差异表达基因分析及qRT-PCR验证 |
| 4.2.9 SSN-EndoG的序列分析 |
| 4.2.10 RGNNV感染或过表达EndoG可以诱导SSN-1 细胞的凋亡 |
| 4.2.11 RGNNV感染可以诱导SSN-1 细胞中EndoG的大量表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 RGNNV感染GF-1 和SSN-1 细胞的转录组比较研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 GF-1 和SSN-1 细胞转录组测序组装结果比较 |
| 5.2.2 GF-1 和SSN-1 细胞转录组unigene注释及功能富集比较 |
| 5.2.3 RGNNV感染前后GF-1 和SSN-1 细胞的DEG比较 |
| 5.2.4 RGNNV感染GF-1 和SSN-1 细胞凋亡途径相关的unigene比较 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 斜带石斑鱼GF-1 细胞和纹月鳢SSN-1 细胞unigene的同源物种分析 |
| 5.3.2 已有 NNV 感染相关的转录组测序比较 |
| 5.3.3 RGNNV诱导GF-1 和SSN-1 细胞凋亡途径的比较 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 鳜脑细胞CPB及鳜对RGNNV敏感性的研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 主要试剂及仪器 |
| 6.1.3 主要试剂的配制 |
| 6.1.4 CPB细胞的培养 |
| 6.1.5 RGNNV的分离 |
| 6.1.6 RT-PCR检测RGNNV |
| 6.1.7 RGNNV感染CPB细胞的形态学观察和RT-PCR验证 |
| 6.1.8 qRT-PCR检测RGNNV在CPB细胞上的增殖 |
| 6.1.9 RGNNV诱导CPB细胞凋亡的检测 |
| 6.1.10 眼球注射检测鳜对RGNNV的敏感性 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 石斑鱼病料RGNNV检测 |
| 6.2.2 CPB细胞对RGNNV敏感 |
| 6.2.3 RGNNV感染可以诱导CPB细胞的凋亡 |
| 6.2.4 RGNNV可以感染鳜脑组织并造成鳜游泳异常 |
| 6.2.5 H&E染色可见鳜脑组织的空泡化 |
| 6.2.6 电镜观察可见鳜脑组织中的RGNNV病毒粒子 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 斜带石斑鱼GF-1 细胞已知miRNA统计 |
| 附录2 斜带石斑鱼GF-1 细胞新预测miRNA统计 |
| 附录3 斜带石斑鱼GF-1 和GS细胞中鉴定到的已知miRNA比较 |
| 附录4 比较斜带石斑鱼和其它代表性动物的miRNA种类 |
| 附录5 RGNNV感染后 3 h GF-1 细胞中的差异表达miRNA |
| 附录6 RGNNV感染后 24 h GF-1 细胞中的差异表达miRNA |
| 附录7 免疫相关KEGG通路的斜带石斑鱼miRNA靶基因分析 |
| 附录8 SSN-1 转录组KEGG通路列表 |
| 附录9 RGNNV感染SSN-1 细胞后DEG的KEGG通路 |
| 博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 1 鱼类神经坏死病毒及其研究概况 |
| 1.1 病毒的发现 |
| 1.2 病毒的命名、分布和分类系统 |
| 2 病毒的基因组结构与进化 |
| 3 病毒编码蛋白与主要功能 |
| 3.1 RNA聚合酶 |
| 3.2 B1蛋白 |
| 3.3 B2蛋白 |
| 3.4 衣壳蛋白 |
| 4 病毒的检测、流行病学和感染模式的建立 |
| 5 病毒性神经坏死症的防治对策 |
| 6 存在的问题与发展趋势 |
