孙振文[1]（2020）在《CHO细胞源口蹄疫多表位疫苗的初步研究》文中认为中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell,CHO）作为哺乳动物细胞真核表达系统,不仅能重组蛋白的天然结构,而且最大化保证了重组蛋白的生物学和免疫学功能,已广泛用于生产医用药物、细胞因子和单抗等生物制剂。由于生产成本高,还没有广泛用于生产兽用疫苗抗原及其生物制剂,也没有用于口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）重组抗原的生产。目前口蹄疫（Foot-and-mouth diseas,FMD）重组亚单位疫苗重组抗原的生产大多采用原核表达系统,并不能保证其抗原天然结构和生物学功能。因此,开发可高水平分泌表达具有天然结构的FMDV抗原的基因工程细胞系显得尤为重要,也是未来疫苗研究的发展趋势。为此,本研究以O型FMDV抗原表位为材料,CHO细胞为研究对象,利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术为手段,构建组成型高水平分泌FMDV抗原的基因工程细胞系,为规模化生产具有天然结构和功能的FMDV重组抗原提供生产用基因工程CHO细胞系。首先,利用信息学技术预测、筛选能提高CHO细胞分泌表达O型FMDV抗原表位（OME1）的信号肽,设计信号肽-（OME1）融合基因,构建不同信号肽-OME1的pCI-neo重组真核表达质粒,转染CHO细胞筛选能提供目的蛋白分泌表达的信号肽。WB结果显示,有9种信号肽促进OME1融合基因在CHO细胞内实现了分泌表达,其中SCGB1D1 isoform信号肽-OME1的重组蛋白量最高,是一种适合CHO细胞分泌表达FMDV重组抗原的信号肽。其次,以SCGB1D1 isoform信号肽和重新串联的O型FMDV抗原表位（OME2）为元件,能自组装病毒样颗粒（VLPs）的HBcAg为骨架,设计SCGB1D1 isoform-HBcAg-OME2融合基因,构建携带SCGB1D1 isoform-HBcAg-OME2融合基因的供体质粒,利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术将携带SCGB1D1 isoform-HBcAgOME2的融合基因整合到CHO细胞染色体的HPRT次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因和8号染色体端粒区,构建携带SCGB1D1 isoform-HBc Ag-OME2融合基因的基因工程CHO细胞。经抗性压力筛选300个CHO细胞岛,并对其进行了扩增培养,免疫荧光显微镜观察到克隆的CHO细胞有大量的绿色荧光,并对其进行鉴定,Junction PCR从克隆的CHO细胞基因组中检测到了SCGB1D1isoform-HBc Ag-OME融合基因,提示基因成功整合进CHO,WB结果显示,CHO细胞培养液中含有能与抗his-tag抗体和O型FMDV阳性血清发生免疫反应的蛋白质成分,再次证实,融合基因整合成功,而且以组成型分泌表达。充分说明本研究成功构建了能以组成型分泌表达FMD重组抗原的基因工程CHO细胞系。总之,本研究不仅筛选到了一种能够促进CHO细胞高效分泌表达FMDV抗原表位重组蛋白的信号肽,而且成功构建了能以组成型分泌表达FMD重组抗原的基因工程CHO细胞系,这将为利用该细胞系规模化生产具有天然结构,保证其生物学和免疫学功能的FMD疫苗重组抗原提供了物质基础和新线索。
张新科,陈洪元,杨莹,李妍,王凤山[2]（2017）在《载pVAX1/Tat PTD-endostatin壳聚糖纳米基因载体的构建与体外活性评价》文中指出目的构建载内皮抑素（Es）重组表达质粒的壳聚糖纳米基因载体并评价其抑制内皮细胞增殖的活性。方法选用真核表达质粒p VAX1为重组载体,采用PCR及双酶切法制备能够表达Tat PTD-Es融合蛋白的真核表达载体p VAX1/Tat PTD-Es;离子交联法制备壳聚糖载基因纳米粒,琼脂糖凝胶电泳筛选处方,检测纳米粒的形态、Zeta电位及粒径;采用最佳处方比例制备载重组质粒纳米载体,转染人脐静脉内皮细胞HUVEC,采用ELISA法测定分泌型Tat PTD-Es蛋白的表达量,CCK-8法测定对HUVEC的抑制作用,以上两个实验均以LipofectaminTM2000为阳性对照。结果 p VAX1/Tat PTD-Es的真核表达载体构建成功,壳聚糖纳米粒Zeta电位（14.3±1.6）m V,粒径（145±12）nm,纳米粒转染HUVEC后细胞上清中Tat PTD-Es的浓度为（182.5±16.3）ng/m L,壳聚糖基因载体转染HUVEC后对细胞有明显的抑制作用,72 h的抑制率达（53.4±5.4）%（Z=-2.611,P=0.008）。结论构建的壳聚糖纳米基因载体能够成功转染HUVEC并能明显地抑制内皮细胞的增殖。
李家冬,王弘[3]（2017）在《重组蛋白正确折叠与修饰的提高策略》文中进行了进一步梳理随着分子生物学的研究和不断发展,基因表达技术有了很大的进步。到目前为止,人们已经研究出多种表达系统用以生产重组蛋白,但没有一种表达系统能够完全满足当前需要,各种活性肽和蛋白质类药物的需求逐年攀升,不仅对表达量有要求,更需要正确的翻译后折叠、修饰,使表达蛋白和天然构象更加接近,具有更高的活性和稳定性。结合目前的研究工作从表达系统与宿主、分泌表达、共表达、融合表达和培养条件等方面综述了其对重组蛋白正确折叠以及翻译后修饰的影响,并提出可能改进的策略。
王友同,吴文俊,李谦,高美风[4]（2013）在《近年来我国生物技术药物研究进展和趋势》文中提出生物技术是21世纪世界各国竞相发展的经济、技术的制高点,作者站在世界生物技术药物发展总趋势的高度上,具体而微地调查和总结了我国近5年来生物技术药物研究所取得的成果,内容包括:细胞因子、其它蛋白质和多肽药物、融合蛋白、穿膜肽、酶、基因治疗、干细胞、单克隆抗体、治疗性疫苗及多糖药物等。调查发现,在攻克人类顽疾、保障人民身体健康、提高生活质量和发展我国生物技术药物产业方面,由于国内成批有创见的研究成果持续涌现,发展前景一片光明。该文可为有关部门科研规划、确定研究项目、企业锁定发展目标及生物制药人员选择专业发展方向提供参考。
蔡善君,詹文芳,刘锐,谢兵,李红,宿罡[5]（2010）在《分泌人内皮抑素的微囊化基因工程细胞系的构建》文中研究指明目的建立能稳定分泌人内皮抑素（hES）的基因工程细胞系,观察内皮抑素（ES）蛋白和hES的表达。方法以hES重组质粒pcDNA3.0（pcDNA3-Endo）为模板,通过聚合酶链反应（PCR）扩增获得hES基因片段,且在基因前加信号肽序列,将其定向插入真核表达载体绿色荧光蛋白（pEGFP-N1）质粒中,获得重组质粒pEGFP-N1-ES;利用阳离子脂质体介导将其转染到人胚胎肾细胞（HeK-293）细胞中,G418筛选后得到阳性克隆hES/293,采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测转染细胞上清中ES蛋白的表达;用海澡酸钠壳聚糖（ACA）微囊包裹hES/293细胞,分别收集培养3、7、21、35 d的ACA微囊化hES/293细胞的培养上清液,Western blot法检测包裹后培养液上清中hES的表达。结果重组质粒pEGFP-N1-ES经限制性核对内切酶HindⅢ和限制性核酸内切酶BamHⅠ双酶切得到4700碱基对（bp）和600 bp 2条带;PCR扩增出600 bp条带;测序结果与NCBI上序列比对软件（BLAST）比对,同源性达到100%。pEGFP-N1-ES转染HeK-293细胞,经G418筛选后获得阳性克隆,选取筛选的10株单克隆细胞培养上清液进行Western blot分析,在相对分子质量为20×103处出现蛋白条带。在ACA微囊内hES/293细胞随着培养时间的延长,细胞团逐渐长大,充满整个囊内空间。培养3、7、21、35 d时,在相对分子质量为20×103处出现蛋白条带。结论重组pEGFP-N1-ES真核表达载体构建正确,转染HeK-293细胞后可有效的表达hES蛋白,并能分泌到细胞外;微囊化hES/293细胞产生的ES蛋白可以自由扩散出微囊膜外,并呈持续性表达。
赵媛媛[6]（2009）在《内皮抑素—人血清白蛋白融合蛋白的表达及鉴定》文中研究说明1997年,O’Reilly从体外培养的鼠血管内皮瘤细胞的上清液中发现了内皮细胞生长抑素（简称内皮抑素,endostatin,ES）,其分子量为20kDa,它能够特异性地作用于内皮细胞,特别是对微血管的内皮细胞,可以起到抑制其迁移,诱导其调亡的作用。人源内皮抑素和鼠源内皮抑素具有较高的同源性,人内皮抑素分子量约为18kDa,二者约有86%的氨基酸残基完全一致。早在1971年,Folkman就提出可以通过抑制肿瘤血管生成使大部分的肿瘤细胞因缺血、缺氧死亡,从而延缓晚期肿瘤的生长,延长患者带瘤生存期,并抑制肿瘤灶生长,推迟复发。在以往对肿瘤血管发生的研究中发现,肿瘤血管的发生,一方面是由于肿瘤细胞释放血管生成因子激活血管内皮细胞,促进内皮细胞的增殖和迁移,另外一方面是内皮细胞旁分泌某些血管生长因子刺激肿瘤细胞的生长。可以说,肿瘤细胞和内皮细胞的相互作用自始至终贯穿于肿瘤血管生成的全过程。所以,内皮抑素的发现,使Folkman的假说成为可能,为肿瘤治疗提供了新的途径。但是,内皮抑素存在治疗用量较大和在体内的血清半衰期较短（约2h）的缺点,因此,开发经济、长效的内皮抑素是十分有必要的。人血清白蛋白（Human Serum Albumin,HSA）是由585个氨基酸组成,为单链无糖基化的蛋白质。分子量大约为68kDa,是血液中含量最高的单一蛋白,在体内有维持血液渗透压、运输营养和其它重要生物物质的作用。具有无免疫原性,人体相容性好,血清半衰期较长（近19天）的特点,可作为生物活性载体。由于白蛋白融合技术不需要额外的化学修饰,生产工艺简单,底物均一,质量控制相对容易,融合后可以提高目的蛋白的表达水平,而且延长药物半衰期的效果可能更有效,所以近年来受到了广泛的关注。HGS（Human Genome Sciences）公司已经进行了一系列与HSA融合延长蛋白质药物半衰期的研究,公布的临床结果表明HSA-IFNα融合蛋白Albuferon的半衰期长达145h。目前该公司已有白蛋白融合生长激素（Albutropin）,白蛋白融合粒细胞生长因子（Albugranin）以及白蛋白融合干扰素（Albuferon）等产品先后进入了I/II期临床研究。本实验以与白蛋白融合的方式,构建了内皮抑素-人血清白蛋白融合蛋白,以延长内皮抑素在体内的半衰期为目的,为长效内皮抑素的临床前研究奠定基础。并以Pichia pastoris为表达系统,它是甲醇营养型酵母,是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。我们选择使用pPIC9k分泌表达载体,是因为与pPIC9相比,pPIC9k表达载体中增加了一个Kanr基因,使其具有G418抗性,通过使用抗生素G418对转化子进行筛选,希望得到表达量较高的菌株。本研究主要包括以下几个部分:1 pPIC9k/ES-HSA表达载体的构建将本研究室构建好的pPIC9/ES-HSA表达载体和本室保存的pPIC9k载体均使用SalⅠ和BamHⅠ双酶切,获得的ES-HSA融合基因和pPIC9k载体目的片段经过连接后转化,得到重组表达载体pPIC9k/ES-HSA。经SalⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定、SalⅠ单酶切鉴定、PCR鉴定及序列测定比对后,确定构建的pPIC9k/ES-HSA表达载体正确。2 ES-HSA融合蛋白的表达及鉴定将pPIC9k/ES-HSA表达载体使用SalⅠ线性化,电转化入GS115宿主菌中,待转化子生长出后,采用G418抗性法、原位双膜法、转化子表型的筛选及PCR鉴定对其转化子进行筛选。将筛选出的阳性转化子15个进行小量表达,使用BCA法测定蛋白含量,确定表达量相对较高的转化子作为后续实验所用表达菌株,并对其表达上清进行Western Blot测定,确定目的蛋白为ES与HSA的融合蛋白。通过对表达菌株的摇瓶培养,优化其表达时间和表达培养基,确定使用BMMY+培养基进行表达,目的蛋白表达的96h为表达高峰,表达量约为300mg/L。3 ES-HSA融合蛋白的纯化将ES-HSA基因测序正确后所对应的氨基酸序列输入相关网页,对其等电点进行预测,可知pI为6.20。通过对纯化条件的摸索,将表达上清先后经过盐析（硫酸铵沉淀法）、CM Sepharose Fast Flow弱阳离子层析、Q Sepharose Fast Flow强阴离子层析和Blue Sepharose Fast Flow亲和层析四步纯化。纯化后的目的蛋白经SDS-PAGE鉴定,并使用Bandscan软件对其进行分析,ES-HSA融合蛋白的纯度约为93%,收率约为24%。4 ES-HSA融合蛋白的生物活性测定采用MTT法对ES-HSA融合蛋白的体外生物活性进行测定,结果表明该融合蛋白对人脐静脉内皮细胞ECV-304的增殖具有很好的抑制作用,半抑制浓度为8.805μg/mL,指数曲线的拟合r2=0.98668,说明抑制作用呈现良好的剂量依赖关系。在CAM实验测定ES-HSA融合蛋白的体内生物活性中发现,ES-HSA融合蛋白能显着抑制CAM血管生长,使血管网分布较少或血管断裂消失,说明该融合蛋白对新生血管生成有明显的抑制效果。5 ES-HSA融合蛋白的半衰期测定将纯化后的ES-HSA融合蛋白按照1mg/kg的注射剂量注入大鼠的尾静脉,在不同时间点（蛋白注射前、蛋白注射后10min、1h、4h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h和240h）于其眼眶静脉丛进行采血,并分离得到血清。使用ELISA双抗夹心法,测定大鼠血清中人内皮抑素的含量,经软件分析可知ES-HSA融合蛋白的半衰期平均为16.3h,较内皮抑素自身的半衰期有一定的延长。综上所述,本研究成功构建了pPIC9k/ES-HSA表达载体,筛选到了表达量较高的菌株,并对ES-HSA融合蛋白进行了表达、鉴定、纯化、生物活性测定及半衰期的测定。结果表明,本实验获得的ES-HSA融合蛋白表达量较高,具有良好的生物学活性,半衰期有一定的延长,为长效内皮抑素的临床前研究奠定了一定的基础。
洪旭光[7]（2008）在《皱纹盘鲍和栉孔扇贝抗菌肽的研究》文中研究指明皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）和栉孔扇贝（Chlamys farreri）是我国黄渤海区的重要自然资源,也是我国北方的重要养殖品种。九十年代中期以来,病害频繁发生,造成的经济损失达百亿元,直接威胁到现有产业的生存。为了促进我国贝类养殖业的复兴和健康发展,实现我国蓝色农业的可持续化,海水养殖动物的免疫抗病机制成为最突出和亟待解决的问题。抗菌肽（antibacterial peptide）是基因编码的肽类抗菌分子,它们广泛存在于生物体内,是脊椎动物、无脊椎动物和植物的先天性免疫关键因子。长期以来,国内外对抗菌肽的研究主要集中在高等动物和一些低等昆虫方面,海洋抗菌肽研究是10年来发展起来的一个热点。本论文以我国重要海水养殖动物——栉孔扇贝和皱纹盘鲍为研究对象,开展抗菌肽的研究,取得了以下结果:（1）本文利用固相提取和HPLC技术,结合灵敏的酶标抗微生物活性检测法,从栉孔扇贝血液中纯化出1种抗菌肽。经测定其分子量为2000Da,部分氨基酸序列为GQPGHTGNAH……。（2）从作者所在实验室构建的皱纹盘鲍肝肾cDNA文库中,筛选得到了鲍防御素基因EST。通过序列分析,发现该基因cDNA序列编码66个氨基酸残基,其前体由信号肽、前导肽和成熟肽组成。该前体的成熟肽含42个氨基酸,推测分子量为4323Da、等电点为8.02。氨基酸序列同源性分析表明,该多肽与昆虫防御素的相似性最高、达到了70%。因成熟肽二级结构具有典型的昆虫防御素结构特征,作者认为该多肽应属于抗菌肽中的昆虫防御素亚家族,是一种新型抗菌肽,并将其命名为鲍防御素（hd-def）。（3）用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激皱纹盘鲍,能诱导hd-def的表达,且鳗弧菌刺激引起的表达量比金黄色葡萄球菌诱导的高,说明该防御素基因属于诱导型表达。在被检测的5种组织中,hd-def基因仅在肝胰腺中表达,而在其它组织（性腺、鳃、肌肉和外套膜）中均未检测到表达。说明该基因具有明显的组织表达特异。人工感染刺激后,不同时间皱纹盘鲍的hd-def表达量有很大差异。感染早期（2hr）表达非常微弱,4hr时表达量明显增大,感染中晚期（12hr）表达量最大。该结果提示,hd-def基因可能参与皱纹盘鲍的抗细菌感染。（4）采用基因组步移法,获得了4032bp的全长基因组序列。分析表明,该基因由3个内含子和4个外显子编码组成;3个内含子大小分别为497、2357和528bp,其中两个内含子存在于编码信号肽的序列中,这种是一种防御素基因的新结构模式,在其他昆虫防御素均未报道。（5）本文利用酵母表达系统,成功构建鲍hd-def基因的重组表达载体pPIC9k-hddef。重组酵母体外表达4.3kd蛋白,具有抗鳗弧菌和金黄色葡萄球菌的活性。
刘延锋[8]（2008）在《极细链格孢菌激活蛋白PeaT1在毕赤酵母中的表达及其互作蛋白的研究》文中指出本研究室从极细链格孢菌（Alternaria tenuissima） JH505中分离纯化获得一种能诱导植物产生系统抗性、促进植物生长的激活蛋白PeaT1,其表观分子量约为35 kD;克隆了编码该蛋白的基因peaT1（登录号CH44 5335）并在大肠杆菌中获得了表达,确定了表达蛋白具有促进小麦生长和诱导烟草抗TMV的功能。本研究在此基础上,将peaT1基因转入巴斯德毕赤酵母中,建立PeaT1蛋白的毕赤酵母分泌表达系统,为进一步探索利用基因工程手段进行大规模生产激活蛋白奠定了基础。同时为了探讨激活蛋白PeaT1诱导植物系统抗性、促进植物生长的作用机理,本文利用噬菌体展示技术和酵母双杂交技术研究了PeaT1的结合短肽和互作蛋白。主要研究结果如下:1、构建了PeaT1蛋白的毕赤酵母表达体系,获得了具有生物活性的分泌表达蛋白。亚克隆构建了重组表达载体pPIC9K-peaT1,酶切线性化后电击转入毕赤酵母GS115菌株中,经MD平板筛选和PCR鉴定得到整合有外源基因的重组菌株。SDS-PAGE检测表明,表达蛋白的表观分子量约为35 kD,与预期的结果一致。通过胶内酶切与LC-MS技术对重组蛋白进行了鉴定,表明PeaT1蛋白在毕赤酵母中获得了正确表达。重组酵母菌株具有良好的遗传稳定性。HPLC分析显示,培养上清/L经超滤浓缩和离子交换层析后可纯化目的蛋白16.13 mg,蛋白纯度达96%;生物测定结果表明,该纯化蛋白可显着地促进小麦幼苗的生长。2、以PeaT1蛋白为固相筛选分子,对噬菌体十五肽库进行了亲和筛选,获得了与PeaT1蛋白特异结合的短肽。经过三轮的生物淘洗,通过每轮逐渐增加洗脱次数,特异性噬菌体克隆得到了有效富集。经单克隆ELISA鉴定和DNA序列分析获得了9个与PeaT1蛋白特异结合的多肽。在NCBI上提交拟南芥的蛋白质数据库,获得了6个包含上述9个多肽之一的蛋白。3、利用酵母双杂交技术筛选拟南芥cDNA文库,获得PeaT1蛋白的互作蛋白。采用SMART技术,通过RT-PCR和LD-PCR合成了拟南芥的ds cDNA,与线性化的pGADT7-Rec在酵母体内修复酶的作用下同源重组形成完整的AD文库。以PeaT1为诱饵蛋白,共转化酵母细胞,筛选到5个能使报告基因ADE2和HIS3同时转录表达的转化子。α-半乳糖苷酶活性分析表明,它们也都能使第三个报告基因MEL1得以表达,说明它们在酵母体内确实能够与PeaT1诱饵蛋白发生相互作用。序列分析结果显示,5个阳性转化子中的4个序列是一致的,最后得到了2个与PeaT1互作的蛋白,分别命名为PIP-1和PIP-2。4、PIP-1是拟南芥中的ATLFNR1（NADPH脱氢酶）,参与体内电子运输。PIP-2是含有初生多肽复合酶结构域的蛋白,其与烟草NbBTF3（β-NAC）蛋白的相似性为80.6%,也可能对叶绿体和线粒体的发育及生理产生影响,进而对植物的生长产生影响,其功能还有待于进一步验证。
韩苏夏[9]（2008）在《SP-TAT-VP3融合基因表达对肝癌治疗作用的实验研究》文中研究说明近年来,随着分子生物学研究的进展和对肿瘤发病分子机制认识的深入,通过将人的正常基因或有治疗作用的基因以一定的方式导入人体靶细胞的肿瘤基因治疗手段开始进入临床。基因治疗针对的是疾病的根源——异常的基因本身,其理论基础和强大生命力显而易见,因此具有重大的医用价值和巨大的社会价值。肝癌被称为“癌中之王”,是肝胆外科最常见的恶性肿瘤。全世界半数左右的患者集中在我国,每年约有11万人死于肝癌,主要是由于适用于手术切除的病例很少。对于不能手术切除的肝癌,其非手术疗法首选经肝血管化疗栓塞和超声引导经皮穿刺瘤内无水酒精注射,但目前的疗效并不令人满意。上述基因治疗方法可望为肝癌的治疗提供一条新途径。VP3是一种来源于鸡贫血病毒的小蛋白,能特异性诱导肿瘤细胞和转化细胞凋亡,而对正常细胞无凋亡诱导作用。VP3的肿瘤细胞特异性与其在细胞中的亚细胞定位有关,在转化或肿瘤细胞中VP3定位于细胞核,而在正常细胞中定位于细胞质。VP3的磷酸化决定其核定位,在肿瘤细胞中VP3被磷酸化,磷酸化的VP3进入细胞核,并诱导细胞凋亡。VP3诱导的细胞凋亡不依赖p53,不为Bcl-2、Bcl-xL的过表达所抑制,但VP3诱导的快速凋亡效应需要caspase3的活化。VP3具有很强的形成聚合体的倾向,在细胞内表达的VP3以多聚体形式存在,但多聚体的形成和解聚并不是其诱导凋亡所必需的。VP3此种特性向我们展示了其在肿瘤治疗领域诱人前景。HIV-TAT是近年来发现的一种新型的高效运输载体—蛋白质转导结构（proteintransductⅠ-on domains,PTDs）或称细胞穿膜肽（cell penetrating peptides,CPP）。HIV-TAT能穿透细胞膜、细胞核膜,携带肽、蛋白质和DNA分子等进入胞质和胞核发挥生物效应,具有高效性、无须耗能或通过受体转运的特点,为提高靶细胞在体内外的基因转移效率和蛋白质表达提供了一个高效、简便的方法。目前的体内及体外试验显示HIV-TAT可以穿过包括神经元细胞在内的所有组织细胞,且未观察到明显毒副作用。本研究是探寻有效的、安全的和特异的治疗恶性肿瘤的生物学方法。我们选用了鸡贫血病毒的VP3蛋白作为治疗肿瘤的特异分子,使用信号肽序列来实现非肿瘤细胞转导后的长期持续分泌表达。采用TAT-VP3融合表达方式,保证治疗分子可以进入未转染的残余肿瘤细胞和已经转移的肿瘤细胞,并确保治疗分子导入肿瘤细胞核内的靶部位。通过以上设计来实现对肝癌等实体瘤安全有效的特异性治疗。在研究过程中,我们以人肝癌HepG2细胞作为研究对象。通过DNA重组技术,用pCDNA3.1/VP3质粒为模板,构建SP-TAT-VP3融合基因plenti6-V5-D-TOPO?载体。然后用MTT法、Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术分别检测细胞增殖、凋亡活性和细胞周期,并制作动物模型系统研究重组SP-TAT-VP3对HepG2细胞及动物模型的治疗作用。本实验主要结果及结论为:1.成功构建了稳定表达SP-TAT-VP3融合基因的真核表达载体。2.SP-TAT-VP3融合基因的表达可有效的抑制人肝癌HepG2细胞的生长。3.体外实验表明SP-TAT无明显的细胞毒性。4.成功证明SP-TAT-VP3融合基因转染后可有效的分泌至细胞外,并通过旁观者效应起作用。5.体内实验结果表明,SP-TAT-VP3融合基因的表达可以降低人肝癌HepG2细胞的体内成瘤能力,瘤体缩小。因此,SP-TAT-VP3融合基因的表达,能引起肿瘤细胞增殖活性降低、细胞凋亡,并引起细胞周期G1期阻滞,有望成为一种新的肿瘤辅助治疗方法。
刘丽凡[10]（2007）在《重组乳酸菌素GassericinT的表达及活性测定》文中研究表明乳酸菌素gassericin T是一种由Lactobacillus gasseri SBT 2055分泌的一种广谱抗菌的细菌素,对其作用机理及遗传机制都不是很明确。在本研究中,首先对已发表的gassericinT的DNA序列和氨基酸序列进行了序列分析,兼顾大肠杆菌和真核的偏爱密码子对细菌素的编码序列进行优化,在序列两端引入适当的酶切位点,通过重叠延伸PCR法扩增获得目的基因,并在大肠杆菌表达系统pGEX-4T-1/BL21（DE3）中进行了融合表达,融合蛋白经变性、复性、功能性检测,结果表明表达的重组gassericin T蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌、沙门氏菌均有明显的抑制作用,对枯草杆菌也有抑菌作用但对产单核细胞李氏杆菌无明显抑菌效果;我们用巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）表达系统进行分泌表达,构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAP9K,分泌并高效表达了gassericin T,结果显示了其对产单核细胞李氏杆菌的抑菌活性。本试验旨在进行天然gassericin T的大规模表达并进行一些生理生化特性的研究,为进一步探讨其作为食品防腐剂、添加剂的可行性以及在益生素及新药开发等领域的潜在应用价值奠定基础。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 口蹄疫表位疫苗 |
| 1.2 CHO细胞表达系统 |
| 1.2.1 培养基的优化 |
| 1.2.2 高产重组CHO细胞系的构建 |
| 1.3 信号肽在CHO细胞表达系统的应用 |
| 1.4 乙型肝炎病毒核心抗原 |
| 1.4.1 HBcAg插入位点 |
| 1.4.2 插入蛋白大小 |
| 1.4.3 外源片端性质 |
| 1.4.4 HBcAg的免疫原性 |
| 1.5 CRISPR/CAS9在CHO细胞中的应用 |
| 1.5.1 基因敲除 |
| 1.5.2 同源重组 |
| 1.6 目的与意义 |
| 1.6.1 研究目的 |
| 1.6.2 研究意义 |
| 第二章 增强CHO细胞分泌表达O型 FMDV抗原表位重组蛋白的信号肽筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 目的基因设计与优化合成 |
| 2.2.2 信号肽切割位点的信息学分析 |
| 2.2.3 引物设计与合成 |
| 2.2.4 O型FMDV抗原表位重组质粒的构建 |
| 2.2.5 pCI-neo-OME1 质粒鉴定 |
| 2.2.6 pCI-neo-OME1 质粒转染CHO细胞 |
| 2.2.7 Western blot鉴定CHO细胞培养基中O型 FMDV抗原表位重组蛋白累积 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 信号肽切割位点的信息学分析结果 |
| 2.3.2 pCI-neo-OME1 质粒鉴定结果 |
| 2.3.3 不同信号肽介导的O型FMDV抗原表位重组蛋白质分泌水平差异结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 分泌表达信号肽-HBcAg-O型 FMDV抗原表位基因工程CHO细胞系的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.0 CRISPR/Cas9 基因打靶位置确定 |
| 3.2.1 设计引物扩增打靶区域序列及测序 |
| 3.2.2 设计sgRNA |
| 3.2.3 构建打靶质粒 |
| 3.2.4 打靶质粒鉴定 |
| 3.2.5 验证打靶质粒切割效率 |
| 3.2.6 确定同源臂,构建供体质粒 |
| 3.2.7 瞬时转染供体质粒验证表达 |
| 3.2.8 共转染打靶质粒和供体质粒加压筛选阳性克隆 |
| 3.2.9 筛选荧光细胞系 |
| 3.2.10 3'Junction PCR(右同源臂)鉴定细胞 |
| 3.2.11 5'Junction PCR(左同源臂)鉴定细胞 |
| 3.2.12 细胞系目的蛋白表达验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 扩增打靶区域序列及测序结果 |
| 3.3.2 设计sgRNA结果 |
| 3.3.3 打靶质粒鉴定 |
| 3.3.4 打靶质粒切割效率结果 |
| 3.3.5 瞬时转染供体质粒验证表达结果 |
| 3.3.6 同源重组荧光细胞筛选结果 |
| 3.3.7 3’Junction PCR(右同源臂)鉴定细胞结果 |
| 3.3.8 5’Junction PCR(左同源臂)鉴定细胞结果 |
| 3.3.9 细胞系目的蛋白表达验证结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 真核表达载体p VAX1/Tat PTD-Es的构建 |
| 1.2.2 载基因 (p VAX1/Tat PTD-Es) CS NPs的制备 |
| 1.2.3处方筛选 |
| 1.2.4 载基因CS NPs的理化性质检测 |
| 1.2.5 载基因CS NPs转染HUVEC |
| 1.2.6 ELISA检测分泌型Tat PTD-Es蛋白的表达 |
| 1.2.7 CCK-8法检测CS NPs对HUVEC的抑制作用 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒的验证 |
| 2.2 处方筛选 |
| 2.2.1 CS与DNA的最佳包合比筛选 |
| 2.2.2 CS与TPP的比例 |
| 2.2.3 最佳处方筛选 |
| 2.2.4 载基因CS NPs的理化性质检测 |
| 2.3 Tat PTD-Es蛋白在HUVEC培养上清液中的表达 |
| 2.4 对HUVEC增殖的抑制作用 |
| 3 讨论 |
| 1 表达系统及表达宿主的选择 |
| 2 分泌表达 |
| 3 共表达 |
| 4 融合表达 |
| 5 培养条件的影响 |
| 6 结语 |
| 1 细胞因子[3-9] |
| 1.1 白细胞介素 (IL) |
| 1.1.1 h IL-10 |
| 1.1.2 h IL-31 |
| 1.1.3 h IL-32 |
| 1.2 干扰素 (IFN) |
| 1.2.1 新型人复合IFNα |
| 1.2.2 集成IFNα突变体Ⅱ (IFN2-Con-m2) |
| 1.2.3 人共同IFNα (IFN-Con1) |
| 1.3 人干细胞生长因子-α (rhSCGF-α) |
| 1.4 人胰岛素样生长因子1 (hIGF-1) |
| 1.5 人血管内皮生长因子 (h VEGF165) |
| 1.6 人内皮抑素 (rhEndostatin) |
| 1.7 人血管能抑素 (canstatin) |
| 2 蛋白质、多肽[10-12] |
| 2.1 水蛭素Ⅲ (HVⅢ) |
| 2.2 人胰高血糖素样肽-2类似物[ (PP-h|Gly 2|GLP-2 (1-35) ] |
| 2.3 人β-2 glycoprotein I |
| 2.4 MAP30蛋白 |
| 2.5 Exendin-4类似物 |
| 2.6 新型Ⅱa类细菌素 |
| 2.7 截短肠毒素C2 |
| 2.8 胰生定多肽 (EXf) |
| 2.9 CKLF-C19 |
| 2.10 人胰岛新生相关蛋白 (INGAP) |
| 2.11 人源肝星状激活相关蛋白 (STAP) |
| 2.12 人凋亡素α-配体 (rh-Apoα) |
| 2.13 人胸腺素β16 |
| 2.14 神经保护肽 ([Gly-14]-Humanin) |
| 2.15 鲨肝活性蛋白 (rSHAP) |
| 2.16 抗癌多肽A38 |
| 2.17 抗纤维化小肽AcSDKP |
| 2.18 血管紧张素1-7改构体 |
| 2.19 抗肿瘤多肽AP25 |
| 2.20 酪丝亮肽 |
| 3 融合蛋白[13-17] |
| 3.1 双 (多) 功能融合蛋白 |
| 3.2 HSA修饰的融合蛋白 |
| 3.3 穿膜肽修饰的融合蛋白[18] |
| 3.4 蛋白质分子PEG后修饰[19] |
| 4 穿膜肽 (CPPs) |
| 5 酶 |
| 5.1 重组蛇毒纤溶酶 (ralfimeprase, ALF) |
| 5.2 蛇毒类凝血酶 (ancrod) |
| 5.3 蚯蚓纤溶酶 (EFE) |
| 5.4 嗜血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂 (Bat-PA) |
| 5.5 人过氧化氢酶 (CAT) |
| 5.6 海刺参i型溶菌酶 (rSjLys) |
| 5.7 人纤溶酶原 |
| 5.8 含精-甘-天冬酰胺三肽人纤溶酶原K区缺失突变体 (RGD-hPLG-K) |
| 5.9 人溶菌酶 (hLYZ) |
| 5.10 尿酸氧化酶 (Uricase) [21] |
| 5.11 人源基质蛋白酶-2 (MMP-2) 的C端类血红素结合域片段 (PEX) |
| 5.12 β-内酰胺酶[22] |
| 6 基因治疗 |
| 6.1 siRNA[23-27] |
| 6.2 反义核酸 |
| 6.3 治疗基因 |
| (1) 抑瘤素M (OSM) 重组腺病毒载体 (Ad-OSM) |
| (2) miR29C重组腺病毒 (Ad5F11p-miR29C) |
| (3) 人肝细胞生长因子重组质粒 (pUDK-HGF) [30] |
| (4) 腺病毒Ela基因-P1b抑癌基因 (AdCMV-P16) |
| (5) 新型增殖型腺病毒 (CNHK500-hγ) [31] |
| 7 干细胞 |
| 7.1 国家SFDA批准临床的干细胞项目 |
| 7.2 干细胞治疗是一种医疗技术还是细胞药物 |
| 7.3 用于临床的干细胞 |
| 7.4 我国近期干细胞临床和药理学药效学研究 |
| 7.4.1 临床研究[32-35] |
| 7.4.2 药理药效学研究 |
| 8 单克隆抗体 |
| 8.1 我国批准的单抗 |
| 8.2 正在临床研究的单抗 |
| 8.3 正在进行临床前研究的单抗 |
| 8.4 单抗阶段性研究[36-38] |
| 9 治疗性疫苗 |
| 9.1 10个世界上正在开发的热点治疗性疫苗 |
| 9.2 我国治疗性疫苗的进展 |
| 9.2.1 口服幽门螺旋杆菌疫苗 |
| 9.2.2 乙肝治疗性疫苗 |
| 9.2.3 子宫颈癌治疗疫苗 |
| 9.2.4 艾滋病疫苗 |
| 9.2.5 疟原虫感染与肺癌DNA疫苗联用 |
| 9.2.6 其它的基因疫苗的研究成果[39-42] |
| 9.2.7 细胞疫苗 |
| 10 多糖 |
| 10.1 毛细管电泳法分析肝素 |
| 10.2 低分子硫酸皮肤素 (LMWDS) [44] |
| 10.3 羧甲基壳聚糖钙 |
| 10.4 低分子壳聚糖衍生物 |
| 10.5 海参岩藻聚糖硫酸酯 (SC-FUC) |
| 10.6 海洋硫酸多糖 |
| 10.7 岩藻硫酸酯 |
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 重组质粒pPIC9k/ES-HSA的构建 |
| 3 重组质粒pPIC9k/ES-HSA转化入酵母 |
| 4 转化子的筛选 |
| 5 阳性转化子的小量表达及鉴定 |
| 6 诱导时间及表达培养基的优化及鉴定 |
| 7 测定ES-HSA融合蛋白的表达量 |
| 8 ES-HSA融合蛋白的纯化 |
| 9 MTT法检测ES-HSA融合蛋白的体外生物学活性 |
| 10 CAM法检测ES-HSA融合蛋白的体内生物学活性 |
| 11 ES-HSA融合蛋白半衰期的测定 |
| 结果 |
| 1 重组质粒pPIC9k/ES-HSA的构建与鉴定 |
| 2 转化酵母重组蛋白的筛选及鉴定 |
| 3 转化酵母重组蛋白的小量表达及鉴定 |
| 4 诱导时间及表达培养基对表达量的影响 |
| 5 ES-HSA融合蛋白的纯化及鉴定 |
| 6 MTT法检测ES-HSA融合蛋白的体外生物学活性 |
| 7 CAM法检测ES-HSA融合蛋白的体内生物学活性 |
| 8 ELISA法测定ES-HSA融合蛋白的半衰期 |
| 讨论 |
| 1 巴斯德毕赤表达系统的优点 |
| 2 表达条件的优化 |
| 3 ES-HSA融合蛋白的纯化 |
| 4 ES-HSA融合蛋白的体内外生物活性 |
| 5 ES-HSA融合蛋白的半衰期 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 已发表与待发表的文章 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第一节 抗菌肽的研究进展 |
| 1.1 抗菌肽的基本特性 |
| 1.2 抗菌肽的种类和结构 |
| 1.3 抗菌肽生物学效应及机制研究 |
| 1.3.1 对微生物等的直接杀灭或抑制作用 |
| 1.3.2 抗菌肽的免疫防御作用 |
| 1.4 抗菌肽基因的表达与调控 |
| 1.4.1 基因定位 |
| 1.4.2 基因调控与机制 |
| 1.5 抗菌肽的开发与应用前景 |
| 1.5.1 药物开发 |
| 1.5.2 转基因生物和抗病品种培育 |
| 1.5.3 保鲜剂和饲料添加剂 |
| 第二节 海洋抗菌肽研究进展 |
| 2.1 海洋抗菌肽的种类与结构 |
| 2.2 海洋抗菌肽的功能 |
| 2.3 海洋抗菌肽的基因克隆 |
| 2.4 抗菌肽的免疫防御与基因表达 |
| 2.5 海洋抗菌肽的重组表达 |
| 第三节 毕赤酵母体外重组表达系统 |
| 3.1 巴斯德毕赤酵母细胞的基本特性 |
| 3.2 影响外源蛋白表达的因素 |
| 3.3 毕赤酵母表达系统的应用与展望 |
| 第四节 研究目的、意义和内容 |
| 4.1 鲍和扇贝的养殖现状与存在问题 |
| 4.1.1 鲍 |
| 4.1.2 扇贝 |
| 4.2 研究意义和内容 |
| 第二章 栉孔扇贝抗菌肽分离纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品采集 |
| 1.2 酸性提取 |
| 1.3 固相提取（SPE） |
| 1.4 HPLC 纯化 |
| 1.5 微生物检测 |
| 1.6 测序 |
| 2 结果 |
| 2.1 诱导与粗提 |
| 2.2 稻瘟真菌模型实验 |
| 2.3 抗菌肽纯化 |
| 2.4 序列测定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 皱纹盘鲍防御素和基因表达 |
| 第一节 皱纹盘鲍防御素及cDNA 序列分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二节 皱纹盘鲍防御素基因表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物和试剂 |
| 2.1.2 总RNA 的提取 |
| 2.1.3 cDNA 合成 |
| 2.1.4 半定量rt－PCR 扩增 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第四章 皱纹盘鲍防御素（hd-def）的基因组克隆与结构分析.. |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物与试剂 |
| 1.2 基因组DNA 提取 |
| 1.3 hd-def 编码区基因组克隆 |
| 1.4 侧翼序列的基因组克隆 |
| 1.5 PCR 扩增产物回收、转化、测序 |
| 1.6 鲍防御素基因组结构分析 |
| 2 结果 |
| 2.1.h d-def 的基因组克隆 |
| 2.2 鲍防御素基因组结构 |
| 3 讨论 |
| 第五章 皱纹盘鲍防御素重组表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 表达载体和培养基 |
| 1.2 目的基因的获得 |
| 1.3 过渡载体pPIC 9-hddef 的构建 |
| 1.3.1 碱裂解法大量提取质粒pPIC9 |
| 1.3.2 质粒pPIC9 的双酶切 |
| 1.3.3 连接反应和转化 |
| 1.4 表达载体pPIC9k-hddef 的构建 |
| 1.5 毕赤酵母电转化和阳性转化子筛选 |
| 1.5.1 重组表达质粒pPIc9k-hddef 的线性化 |
| 1.5.2 重组表达质粒脱磷酸化处理 |
| 1.5.3 感受态酵母制备 |
| 1.5.4 电击转化 |
| 1.5.5 毕赤酵母基因组提取和PCR 鉴定重组子 |
| 1.6 重组酵母的诱导表达 |
| 1.7 酵母表达外源蛋白质的SDS-PAGE |
| 1.8 重组表达产物的活性检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 表达载体的构建 |
| 2.2 转化与诱导表达 |
| 2.3 生物学活性 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 博士论文期间发表和完成论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 蛋白激发子 |
| 1.2 极细链格孢菌植物激活蛋白 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达系统的生物学及遗传特性 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统的优点 |
| 1.3.3 毕赤酵母表达宿主菌 |
| 1.3.4 毕赤酵母表达载体 |
| 1.3.5 外源基因在毕赤酵母中的表达 |
| 1.3.6 毕赤酵母表达系统的局限性及解决策略 |
| 1.4 蛋白质相互作用的研究方法 |
| 1.4.1 噬菌体展示系统 |
| 1.4.2 酵母双杂交系统 |
| 1.4.3 免疫共沉淀 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 PeaT1 在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 重组酵母表达载体pPIC9K-peaT1 的构建及鉴定 |
| 2.2.2 酵母的转化及筛选 |
| 2.2.3 重组酵母的PCR 鉴定 |
| 2.2.4 表达产物的SDS-PAGE 分析 |
| 2.2.5 表达蛋白的质谱鉴定 |
| 2.2.6 重组酵母蛋白表达量与诱导培养时间的关系 |
| 2.2.7 表达蛋白的热稳定性分析 |
| 2.2.8 重组酵母遗传稳定性分析 |
| 2.2.9 表达蛋白的分离纯化 |
| 2.2.10 纯化蛋白的HPLC 分析 |
| 2.2.11 纯化的表达蛋白对小麦幼苗生长的影响 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 利用噬菌体展示技术筛选 PeaT1 的结合多肽 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 饥饿态细胞的制备 |
| 3.1.3 亲和淘洗 |
| 3.1.4 噬菌体的滴定与扩增 |
| 3.1.5 噬菌体的纯化 |
| 3.1.6 ELISA 鉴定噬菌体克隆的结合活性 |
| 3.1.7 噬菌体单链DNA 的提取和序列测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 高亲和力的噬菌体筛选 |
| 3.2.2 ELISA 鉴定噬菌体克隆的结合活性 |
| 3.2.3 单克隆噬菌体序列测定与氨基酸分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 利用酵母双杂交筛选 PeaT1 的互作蛋白 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 诱饵载体pGBKT7-peaT1 的构建及鉴定 |
| 4.2.2 诱饵载体pGBKT7-peaT1 转录激活特性及诱饵蛋白毒性分析 |
| 4.2.3 拟南芥ds cDNA 的合成 |
| 4.2.4 酵母双杂交文库的建立和筛选 |
| 4.2.5 Ade+His+转化子的α-半乳糖苷酶活性分析 |
| 4.2.6 酵母质粒的提取及双酶切鉴定 |
| 4.2.7 阳性克隆测序分析 |
| 4.2.8 阳性克隆的再次验证 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 PeaT1 互作蛋白功能分析 |
| 5.1 噬菌体展示技术与酵母双杂交筛选结果的分析 |
| 5.2 PeaT1 互作蛋白 PIP-2 的结构与功能分析 |
| 全文结论 |
| 1、构建了 PeaT1 在毕赤酵母中的分泌表达系统 |
| 2、利用噬菌体展示技术获得了9 个结合短肽 |
| 3、利用酵母双杂交技术获得了两个互作蛋白 |
| 4、互作蛋白的同源比对分析 |
| 5、本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 论文发表情况 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 肿瘤的基因治疗 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 肿瘤基因治疗常用策略 |
| 1.1.3 小结 |
| 1.2 VP3 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 VP3与鸡贫血病毒 |
| 1.2.3 VP3诱导的肿瘤细胞凋亡 |
| 1.3 蛋白转导域研究进展 |
| 1.3.1 蛋白转导域与HIV-TAT蛋白转导结构域 |
| 1.3.2 蛋白转导域的作用机制 |
| 1.3.3 TAT-PTD转导的优越性 |
| 1.3.4 PTD融合分子的制备 |
| 1.3.5 PTD在医学中的应用 |
| 1.3.6 问题与展望 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 质粒和菌种 |
| 2.2 细胞系 |
| 2.3 实验动物 |
| 2.4 主要试剂 |
| 2.5 主要溶液配制和使用仪器 |
| 3 SP-TAT-VP3融合基因真核表达载体的构建 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.1.1 SP-TAT-VP3融合基因PCR引物的设计与合成 |
| 3.1.2 SP-TAT-VP3融合基因与plenti6-V5-D-TOPO(?)表达载体的连接及筛选鉴定 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 SP-TAT-VP3融合基因PCR引物的设计与合成 |
| 3.2.2 SP-TAT-VP3融合基因的合成和真核表达载体的构建 |
| 3.3 讨论 |
| 4 SP-TAT-VP3融合基因的表达对HepG2细胞生物学特性的影响 |
| 4.1 实验方法 |
| 4.1.1 细胞培养 |
| 4.1.2 Blasticidin霉素筛选浓度的确定 |
| 4.1.3 脂质体介导基因转染 |
| 4.1.4 单克隆细胞株的筛选 |
| 4.1.5 瞬时转染与共培养 |
| 4.1.6 RT—PCR检测SP-TAT-VP3融合基因的RNA表达水平 |
| 4.1.7 Western blot检测SP-TAT-VP3融合基因蛋白表达水平 |
| 4.1.8 免疫荧光细胞化学的间接染色方法检测SP-TAT-VP3融合基因蛋白表达 |
| 4.1.9 细胞增殖活性的检测 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 SP-TAT-VP3融合基因表达载体转染后HepG2细胞体外增殖能力明显下降 |
| 4.2.2 Blasticidin霉素筛选浓度确定和筛选稳定表达SP-TAT-VP3融合基因的单克隆细胞 |
| 4.2.3 SP-TAT-VP3融合蛋白的分泌表达及TAT-VP3对HepG2细胞的生长抑制作用 |
| 4.2.4 共培养后的HepG2细胞可观察到细胞周期G1期阻滞 |
| 4.2.5 SP-TAT的毒性检测 |
| 4.3 讨论 |
| 5 SP-TAT-VP3融合基因的表达对裸鼠移植瘤的抑制作用 |
| 5.1 实验方法 |
| 5.1.1 裸鼠成瘤实验 |
| 5.1.2 制备形态学标本 |
| 5.1.3 免疫组织化学反应 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的成果 |
| 致谢 |
| 内容提要 |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 综述 |
| 第一章 乳酸菌细菌素的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 乳酸菌素GassericinT 基因的设计、拼接与克隆 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 乳酸菌素GassericinT 基因在大肠杆菌中的表达及活性测定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 乳酸菌素GassericinT 基因在毕赤酵母中的表达及活性测定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师及作者简介 |
