原发性肝癌体内基因治疗的研究与进展

一、原发性肝癌的体内基因治疗研究与进展（论文文献综述）

倪彩菊^[1]（2021）在《856例少数民族地区中晚期原发性肝癌临床特征分析》文中研究表明目的:收集中晚期原发性肝癌患者的临床资料,分析晚期患者与中期患者临床特征的差异,探讨不同治疗方式对患者预后的影响,为今后民族地区肝癌的诊治提供参考。方法:收集2016年1月至2019年9月在右江民族医学院附属医院住院治疗的856例中晚期原发性肝癌患者临床资料,包括一般资料、既往史、就诊原因、HBV病毒、肿瘤标志物、肝功能指标、Child-Pugh分级、门脉癌栓、治疗方法和生存期等。（1）根据BCLC分期,分为BCLC-B期（中期）患者642例和BCLC-C期（晚期）患者214例。分析两组患者临床特征的差异。（2）根据患者是否进行TACE手术治疗,分为TACE组和非TACE组。TACE组622例,非TACE组234例。比较两组间术后生存期的差异。（3）根据不同治疗方式将患者分为5组:（1）单纯TACE组297例;（2）TACE+索拉菲尼组119例;（3）TACE+消融组152例;（4）手术+TACE组28例;（5）手术+TACE+消融组26例。比较各组间术后生存期的差异。结果:（1）中期患者与晚期患者发病年龄、男性比例、平均BMI、平均住院次数,差异均无显着统计学意义（P>0.05）。吸烟史比例、癌症家族史比例、糖尿病史比例、HBV感染史比例、HCV感染史比例、脂肪肝史比例、肝硬化史比例等方面,差异均无显着统计学意义（P>0.05）。（2）与中期患者比较,晚期患者AFP、CEA、CA125、CA199阳性比例显着升高;TBIL、ALT、AST、GGT及ALB水平显着升高;Child-Pugh B级患者比例显着升高;门脉癌栓比例显着升高,差异有统计学意义（P<0.05）（3）是否进行TACE治疗对患者生存期影响:（1）TACE治疗患者6和12个月的生存率显着高于非TACE治疗患者,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）TACE治疗的中期患者的6和12个月生存率显着高于TACE治疗的晚期患者,差异有统计学意义（P<0.05）;（3）非TACE治疗的中期患者的6和12个月生存率显着高于非TACE治疗的晚期患者,差异有统计学意义（P<0.05）;（4）TACE治疗的中期或晚期患者的6和12个月生存率显着高于同期非TACE治疗的患者,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）TACE联合其他方案对患者生存期影响:（1）TACE联合其他方案治疗时,6个月和12个月的生存率均显着高于单纯TACE治疗,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）TACE+手术+消融治疗时,3个月和12个月生存率显着高于其他联合治疗方案,差异有统计学意义（P<0.05）。（5）TACE联合其他方案对中期患者、晚期患者生存期影响:（1）对于中期患者,TACE联合其他治疗方案的6和12个月生存率均显着高于单纯TACE组,差异有统计学意义（P<0.05）;手术+TACE+消融组12个月生存率均显着高于其他联合治疗组,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）对于晚期患者:TACE联合其他治疗方案的12个月生存率均显着高于单纯TACE组,差异有统计学意义（P<0.05）;手术+TACE+消融组12个月生存率均显着高于其他联合治疗组,差异有统计学意义（P<0.05）。（6）年龄、住院次数、门静脉癌栓、Child-Pugh分级及是否进行TACE治疗是影响原发性肝癌患者预后的主要因素。结论:中晚期原发性肝癌患者以男性比例高于女性,发病高峰期为50～59及60～69岁两个年龄段,民族分布方面以壮族及汉族患者最为常见,其它民族包括布依族、瑶族和彝族等。中晚期患者在肿瘤标志物阳性率和肝功能指标方面存在显着差异。高龄、住院次数少、伴门静脉癌栓、Child-Pugh分级为B级以及未进行TACE治疗是影响原发性肝癌患者生存率的高危因素。对于中晚期患者,特别是晚期患者,积极的TACE治疗以及联合靶向药物治疗、消融治疗和手术治疗等,有助于提高患者生存率。

孙新锋^[2]（2021）在《芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究》文中提出背景:原发性肝癌是一个全球性的健康问题,其中90%为肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）,是第二位致死性肿瘤,5年生存率仅为18%,HCC早期可选择肝移植、手术切除或射频消融等根治性治疗,中晚期化疗栓塞/放射栓塞和全身系统治疗是仅存的治疗方法。和大多数肿瘤一样,HCC中存在干性癌细胞,即癌干细胞（cancer stem cell,CSC）,是具有无限增殖和分化潜能的一类特殊细胞群,特别是在HCC的复发转移过程中起着关键作用。癌干细胞标志物是一种特异性的信号分子或蛋白质受体,是利用其鉴定癌干细胞最简单的方法。很多研究表明癌干细胞表面标记物是影响HCC固有耐药性和侵袭转移能力以及调节其干性的关键因素。随着对癌干细胞的深入研究,越来越多的癌干细胞标记物被发现,在体内成瘤实验中确证过,常见的有EpCAM、CD133、CD44及SOX4等癌干细胞表面蛋白,这些标记物在上皮癌变过程中具有一定的促进作用,它的活化和显着表达与肿瘤的活性、侵袭能力和恶性程度呈正相关。最近研究表明,HCC癌干细胞的存在是影响临床疗效导致HCC患者死亡的主要原因之一。中医药是中华民族传统文化与智慧的结晶,具有毒副反应少、多组分、治疗靶点多、减毒增效等特点,能够优化HCC治疗早已形成共识,导师在传承的基础上,创新和发展传统中医宏观气血辨证论治思想,对芪术抗癌方治疗HCC宏观和微观物质基础进行了一系列研究,本方以由黄芪、莪术、炒白术、柴胡、白芍、鸡内金及炙甘草等药物组成。前期临床研观察发现,该方可显着提高HCC患者临床疗效,明显改善生存质量、减少肿瘤的复发和转移并提高患者的生存率。进一步研究发现该方能阻止癌细胞转移、诱导HepG2细胞凋亡、p53蛋白表达及p21细胞周期调控等;并通过调节JNKs信号通路促进HepG2细胞凋亡、阻止裸鼠HCC转移,及逆转TGF-β诱导的肝癌细胞EMT和干性特征减少癌细胞迁移等。故系统深入研究HCC癌干细胞的侵袭转移机制以及寻求新的治疗方法,是提高疗效、改善预后及延长生存率的关键环节。通过对癌干细胞的起源、生物学特征及作用和机制初步的阐述,进一步研究HCC转移和复发机制,探讨中药阻止HCC进展的疗效机制具有重要意义。目的:芪术抗癌方可能会影响癌细胞干性标志物表达从而影响HCC复发和转移;据此,本研究拟在导师前期工作基础上,（1）通过对HCC患者外周血淋巴细胞（PBMC）进行癌干性标志物高通量测序以验证主要干性相关标志物基因及SOX4的表达;（2）建立芪术抗癌方处理HepG2细胞损伤模型,验证芪术抗癌方对肝癌细胞株干性标志物表达的影响。（3）建立肝癌原位小鼠动物模型,验证芪术抗癌方对干性标志EpCAM、CD133、CD44表达和对SOX4基因表达的影响。本研究结果,有望在肿瘤干性标志物方面初步阐释芪术抗癌方阻止HCC进展的疗效作用机制,为中药抗癌制剂的研发和广泛的临床应用提供理论和实验依据。方法:第一部分:收集正常对照人群、HCC患者血液标本,通过PBMC高通量测序及蛋白芯片表达,研究不同分期分级HCC患者之间干性标志及SOX4表达差异,并与正常对照人群进行对比分析。1.经医院伦理委员会批准依据我国《原发性肝癌诊疗规范》（2017年版）选择确诊为肝细胞癌患者,共80例,其中年龄在30岁至70岁之间,平均年龄51.2岁。根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期,80例HCC患者,根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期:其中0期5例,A期21例,B期14例,C期25例,D期15例;为了进一步区分HCC组癌干性基因表达,我们选取了正常对照组,随机入组50例正常人群作为对照组,同时对入组进行统计学分析。2.对入组者进行外周血单个核细胞（PBMC）提取A.使用量约5ml的EDTA抗凝真空采血管进行血液采集,上下颠倒与抗凝剂混合均匀后放入4℃冰箱保存,并在2小时内完成PBMC提取。B.对入组标本进行RNA提取与检测,包括Trizol法提RNA,Thermo试剂盒法进行细胞裂解、RNA萃取、RNA清洗、Elute RNA、RNA检测,对文库构建与质控,库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina 测序。C.数据对比分析:采用Subread软件中的FeatureCounts工具对基因进行表达水平的定量,FeatureCounts主要使用-Q 10-B-C参数,分别过滤掉比对质量值低于10的reads,非成对比对上的reads,比对到基因组多个区域的reads。3.随机抽取36例肝癌患者和对照组血浆标本进行蛋白数据进行分析,包括原始数据归一化,差异蛋白筛选,差异蛋白聚类等基础分析。第二部分:芪术抗癌方体外、体内实验研究1.芪术抗癌方对癌细胞干性标志表达影响的体外肝癌细胞研究通过体外实验,观察芪术抗癌方是否影响TGF-β1诱导的肝癌细胞干性标志物表达。利用TGF-β1诱导Huh7细胞干性表达,加入芪术抗癌方浸提液共培养,Western blot检测癌细胞干性相关蛋白表达水平,验证芪术抗癌方对癌细胞干性标志表达的影响。2.芪术抗癌方对癌细胞干性标志及SOX4基因表达影响的体内肝癌动物模型研究2.1肝癌原位模型造模小鼠肝包膜下种植SMMC7721-luc制备肝癌模型,4周后进行活体成像仪查看荧光情况来确认小鼠是否造模成功。2.2分组用耳标法将30只肝癌模型小鼠和5只空白小鼠进行编号,然后将肝癌模型小鼠随机等量分为5组（肝癌模型组、索拉非尼组、芪术抗癌低剂量、中剂量、高剂量组）。空白小鼠则做为对照组。2.3取材给药30天后用安乐处死小鼠,剪开小鼠腹部皮肤2cm,分离肌肉,取出小鼠肝脏、拍照。然后肝脏和肿瘤备用。2.4 HE染色及免疫组织化学染色2.5 PCR定量检测根据实验说明书从肝脏肿瘤组织中提取的总RNA,以RNA为模板,按照说明书配制逆转录反应体系,总体积为20μl,37℃,60min;98℃,10min,合成cDNA第一链,并收集备用;加入特定引物,在PCR反应条件下:94℃ 2min,94℃ 20s,58℃ 20s,72℃ 20s,40循环。PCR产物的特异性通过熔解曲线分析证实。基因表达相对定量与ΔΔCt方法实现（Ct值）。2.6肝癌组织标本进行Western Blot和免疫组化检测。结果:第一部分:收集健康对照组、肝细胞癌患者血液标本,通过PBMC基因测序及蛋白芯片表达,对比健康对照组与HCC、HCC不同分期组之间干性标志物基因、蛋白及SOX4基因表达。本研究中对纳入的80例HCC患者,根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期:其中0期5例,A期21例,B期14例,C期25例,D期15例;同时纳入50例健康人群作为对照组。通过采用RNA-Seq对HCC患者和正常健康对照组外周血淋巴细胞（PBMC）进行高通量测序,及生物信息学方法分析,发现在HCC患者和健康对照者验证队列中,使用qRT-PCR对9个干性基因表达进行验证对比发现,在两者组人群中都存在 CD13、CD24、CD44、CD47、EPCAM、CD133、SOX2、SOX4、CD90等基因表达,并且以CD13、CD24、CD44、CD47、CD133、SOX4表达更显着。对HCC巴塞罗那分期0-B期和C-D期,进一步进行RNA-Seq测序结果分层分析比较,发现在9个癌干性基因表达中,CD13、CD24、CD44、CD47、CD133、SOX4、EpCAM在两组中亦均明显表达,同时发现C-D级较0-B期HCC患者CD133基因表达更为显着,而EpCAM表达0-B期较C-D期患者基因表达有较为明显的表达,同时我们还发现在两组患者中具有同等水平的SOX4的表达。HCC患者和对照组的干性基因表达聚类图进一步分析发现,SOX4基因在HCC组呈现明显的高表达,同样HCC患者PBMC中CD24、CD47、CD13基因表达和健康对照组比较存在显着差异。通过HCC患者血浆蛋白芯片检测,发现HCC患者存在CD44、EpCAM基因高表达。本研究部分,通过RNA-seq技术及血浆芯片蛋白检测技术,确证人PBMC中存在部分干细胞标志物基因表达,通过进一步比较发现,CD133、CD44、EpCAM在肝癌患者中表达明显,且与分期呈现负相关,并发现癌细胞干性调节基因SOX4在HCC患者中高表达,提示,HCC患者PBMC中存在癌干细胞与疾病进展和不良预后相关。第二部分:通过体外、体内实验观察芪术抗癌方对癌干细胞中CD133、CD44、EpCAM及SOX4表达的影响,初步探讨在癌干细胞方面中医药治疗肝癌的作用。1.芪术抗癌方对Huh7肝癌细胞干性标志表达的影响我们体外研究发现,通过对TGF-β1诱导的癌细胞干性标志基因蛋白表达发现,芪术抗癌方干预Huh7肝癌细胞后,能抑制EpCAM和CD133表达,表明该中药复方可以在体外通过抑制癌细胞中EpCAM和CD133干性表达而阻止HCC进展。2.芪术抗癌方对肝癌动物模型癌细胞干性标志及SOX4基因表达的影响EpCAM、CD133、CD44、SOX4等细胞表面蛋白的活化和高表达与肿瘤的活性、侵袭能力和恶性程度呈正相关。我们已对HCC患者PBMC进行了高通量测序研究,发现EpCAM、CD133、CD44、SOX4等干性相关基因,在HCC患者PBMC中表达,及体外实验亦证实了芪术抗癌方可以抑制部分干性标志及SOX4基因表达。由此,我们进行了进一步体内实验研究,验证芪术抗癌方对HCC癌细胞干性标志及SOX4基因表达的影响,初步探索芪术抗癌方阻止HCC进展的疗效机制。我们对实验成功的肝癌原位小鼠动物模型进行分组和处理,并进行PCR、Western Blot及免疫组化染色研究分析,发现芪术抗癌方可以降低癌干细胞EpCAM、CD133和CD44,以及癌细胞干性调节基因SOX4在肝癌肿瘤组织中的表达,并且作用优于索拉菲尼,验证了我们的假设,芪术抗癌方可以通过影响癌细胞干性标志物表达从而阻止HCC进展,其疗效机制可能与调节SOX4基因表达相关。结论:在本研究中,首先通过对临床HCC患者PBMC进行RNA-seq及血浆芯片蛋白检测研究,发现了人PBMC中存在部分干细胞标志物基因表达,通过进一步比较发现,CD133、CD44、EpCAM在肝癌患者中表达明显,且与分期呈现负相关,并发现癌细胞干性调节基因SOX4在HCC患者中高表达,提示,HCC患者PBMC中存在癌干细胞与疾病进展和不良预后相关,而中医药可能通过调节SOX4基因影响干性标志表达。其次,通过体外实验研究发现芪术抗癌方可影响Huh7肝癌细胞中CD133、CD44、EpCAM干性标志表达。最后,我们通过对实验成功的肝癌原位小鼠动物模型进行分组和处理,并进行PCR、Western Blot及免疫组化染色分析研究,发现芪术抗癌方可以降低癌干细胞EpCAM、CD133和CD44,以及癌细胞干性调节基因SOX4在肝癌肿瘤组织中的表达,并且作用优于索拉非尼,验证了我们的假设,芪术抗癌方在体内外实验中能通过影响癌细胞干性标志物表达阻止HCC进展,其疗效机制可能与调节SOX4基因表达相关,为芪术抗癌方进一步深入的疗效机制研究提供了较好的临床及试验证据,为中医药在HCC治疗的临床广泛应用提供了研究依据。

王珂欣^[3]（2021）在《基于新型网络药理学策略解析复方苦参注射液抗肝癌主要药效成分与作用机制》文中指出选题依据:肝癌是世界上流行最高的10种恶性肿瘤之一,死亡率在消化系统恶性肿瘤中位居第二,发病率有上升趋势,而我国每年新发病例占全球一半以上。目前肝癌的治疗手段主要有外科手术切除及放、化疗等,但患者5年内生存率低于30%。因此,探索肝癌发病机制和防治肝癌药物作用机制,是提高肝癌患者生存率和解决临床用药问题的迫切需求。复方苦参注射液在中国已有超过15年的临床应用历史,用于治疗多种类型的实体肿瘤,尤其是癌肿疼痛和消化系统肿瘤中的肝癌。临床研究表明复方苦参注射液可以改善中晚期肝癌患者的症状,且辅助双介入治疗,联合动脉灌注栓塞术,联合化疗均有显着的疗效。实验药理研究表明复方苦参注射液对H22肝癌荷瘤小鼠模型具有抑瘤作用,可显着抑制肝癌细胞增殖,且调控细胞周期。然而,复方苦参注射液在其它肝癌动物模型中是否具有抑制作用?是否具有抑制肝癌转移的作用?除调控凋亡和周期相关信号通路之外,其抑制肝癌细胞增殖及转移的具体机制还有哪些?其抗肝癌的药效物质基础是什么?这些关键科学问题仍然不清晰,需要进行深入、系统的研究。本研究首先从体内外明确了复方苦参注射液抗肝癌的作用;其次,采用计算系统药理学模型预测了复方苦参注射液抗肝癌的药效成分群;最后,基于定量成分导向的网络药理学方法预测了复方苦参注射液抗肝癌的作用机制并进行了验证。研究结果为复方苦参注射液抗肝癌临床用药提供新的科学依据,为进一步开发组分新药提供物质基础,同时也将为其他中药注射剂防治肿瘤研究提供研究思路。目的:（1）明确复方苦参注射液抗肝癌药理作用。（2）构建计算系统药理学模型,探寻复方苦参注射液抗肝癌的药效成分群。（3）基于定量成分导向的网络药理学方法阐释复方苦参注射液抗肝癌的作用机制。方法:（1）通过肝癌细胞增殖和克隆形成实验,以及对二乙基亚硝胺诱发肝癌大鼠肝脏组织的一般和病理学观察及血清生化指标,明确复方苦参注射液对肝癌细胞和大鼠的抑制作用;通过细胞粘附、伤口愈合细胞划痕、Transwell侵袭以及趋化运动实验,明确复方苦参注射液对肝癌细胞侵袭转移的作用。（2）采用计算系统药理学模型,将代谢组学分析、数据收集、网络算法、生物信息学工具相结合,使用一种称为Dijkstra算法模拟药物靶点对疾病分子网络的传播效应,识别出复方苦参注射液抗肝癌药效成分群。（3）通过对复方苦参注射液中高含量成分进行抗肝癌活性筛选,聚焦含量高且活性强的成分,采用网络药理学方法预测复方苦参注射液抗肝癌作用的关键靶点和通路,采用蛋白质免疫印迹技术对预测关键靶点和Wnt/β-catenin信号通路进行体内外验证,明确复方苦参注射液调节Wnt/β-catenin信号通路抗肝癌的机制。采用代谢组学技术,分析复方苦参注射液对差异代谢物的调节作用,阐明复方苦参注射液调节肝癌代谢紊乱的作用机制。最后,整合分析复方苦参注射液抗肝癌作用机制。结果:（1）2 mg/mL复方苦参注射液能显着抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖和克隆形成;1.5和3 mL/kg复方苦参注射液可改善二乙基亚硝胺诱导的肝癌大鼠肝细胞结构的损伤,并不同程度回调肝功能相关指标谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）和γ-谷酰基转肽酶（γ-GT）的水平,表明复方苦参注射液具有抑制肝癌生长的作用。1和2 mg/mL复方苦参注射液具有显着抑制肝癌细胞迁移、侵袭和趋化运动能力,能显着增加细胞-细胞粘附和抑制细胞-基质粘附,表明复方苦参注射液具有抑制肝癌侵袭转移的作用。（2）基于UPLC-MS鉴定出复方苦参注射液中的21个化学成分,多个数据库预测了复方苦参注射液21个化学成分的作用靶点,构建了复方苦参注射液的成分-靶点网络。随后整合了复方苦参注射液调节肝癌代谢紊乱的277个基因作为疾病基因,基于蛋白-蛋白相互作用数据构建了一个全面的复方苦参注射液成分-靶点-互作蛋白-疾病基因网络,并应用Dijkstra算法计算成分的靶点传播到疾病分子网络的最短距离链17412条,从而根据传播系数识别出11个药效成分群:槐定碱、9β-hydroxylamprolobine、苦参碱、槐醇、异苦参碱、（-）-乙酰鹰靛叶碱、N-甲基金雀花碱、氧化槐定碱、氧化苦参碱、氧化槐醇和（-）-oxylehmannine,并从致病基因和功能通路的覆盖率验证了药效成分群的准确性和可靠性。（3）对复方苦参注射液中含量高的5个化合物进行抗肝癌活性筛选,对具有显着肝癌抑制活性的苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱和N-甲基金雀花碱进行网络药理学分析。通过构建复方苦参注射液抗肝癌靶点-相关蛋白网络,预测出关键靶点,在肝癌细胞和大鼠上验证,结果表明复方苦参注射液可以显着增加肝癌细胞和大鼠中CASP3的表达,抑制MMP2,MYC和REG1A的表达。通过对关键蛋白的深入验证发现复方苦参注射液可通过下调细胞和大鼠中Vimentin的表达,增加E-cadherin的表达来抑制上皮间质转化过程。此外,复方苦参注射液可以显着调节细胞和大鼠中Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白β-catenin和GSK-3β及下游蛋白COX2的表达。同时,复方苦参注射液可显着阻滞Wnt/β-catenin信号通路激活剂LiCl所致的肝癌细胞中β-catenin和COX2表达水平的升高和GSK-3β表达水平的降低;可抑制LiCl所致的肝癌细胞中上皮间质转化过程、迁移和侵袭作用,表明复方苦参注射液可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥抗肝癌侵袭转移作用。对网络药理学预测的靶点进行通路富集分析,发现复方苦参注射液发挥抗肝癌作用可能与调节代谢通路相关。肝癌大鼠血清和肝脏代谢组学结果表明复方苦参注射液均能显着调节两种样本中差异代谢物柠檬酸和乳酸的含量,改善肝癌的代谢紊乱,其机制可能涉及糖酵解过程关键代谢物和代谢酶,且Wnt/β-catenin信号通路关键下游靶点c-Myc可能介导复方苦参注射液对糖酵解的抑制作用。对复方苦参注射液抗肝癌作用机制整合分析,表明复方苦参注射液可能通过调节β-catenin/c-Myc信号通路,进而干预肝癌代谢重编程和抑制EMT过程来发挥抗肝癌作用。结论:（1）复方苦参注射液对肝癌细胞和二乙基亚硝胺诱发肝癌大鼠具有抑制作用,具有抑制肝癌细胞侵袭转移的作用。（2）复方苦参注射液抗肝癌的主要药效成分可能为槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱、N-甲基金雀花碱,次要药效成分为槐醇、异苦参碱、（-）-乙酰鹰靛叶碱、氧化槐定碱、氧化槐醇、9β-hydroxylamprolobine和（-）-oxylehmannine。（3）复方苦参注射液可能通过调节β-catenin/c-Myc信号通路中关键蛋白,进而干预肝癌代谢重编程和抑制上皮间质转化过程来发挥抗肝癌作用。（4）本研究提出的计算系统药理学模型可用于中药复方物质基础的研究;定量成分导向网络药理学方法可用于预测成分含量明确的中药复方作用机制。

叶善平^[4]（2021）在《miR-557通过靶向RAB10调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌进展的机制研究》文中研究指明背景:肝癌是国内外严重威胁人类健康的主要癌症之一,其发病率和死亡率在全球所有恶性肿瘤中排第六和第四,其中肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）占原发性肝癌的75%-85%,世界范围内每年可致75万患者死亡。HCC的发病率具有较大的地域异质性,大约有85%的HCC发生在发展中国家和欠发达地区,而其中有50%发生在中国。早期肝癌预后较好,但多数患者在首诊时已处于进展期,而这部分患者的发病率和死亡率比值接近100%。尽管近些年来HCC的治疗取得了一定的进展,但高复发率和高转移率使其预后仍不理想。因此,研究HCC的诱发因素及影响HCC侵袭和转移的过程,进而寻找肝癌的预后生物标记物及潜在治疗靶标是当下重要研究领域。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的,短而高度保守,长度约为18-25个核苷酸的小RNA,呈单链状,不能编码蛋白质,在有核生物中表达较广。miRNA在体内主要起调控作用,通过与m RNA的3’端非编码序列发生碱基配对而起抑制作用,从而实现在转录后阶段调控基因表达。自从第一个miRNA被报道以后,陆续发现并研究了许多miRNA,但对于理解肿瘤发生发展的机制仍是冰山一角。许多研究表明miRNAs与HCC的起病、侵袭、转移及预后关系紧密。其中部分miRNAs在HCC中高表达,起着癌基因的作用,部分miRNAs在HCC中低表达,起着抑癌基因的作用。miR-557是近年来新发现的miRNA,它在胰腺癌、三阴乳腺癌、肺癌中均呈低表达,作为肿瘤抑制基因参与肿瘤侵袭、转移等多种生物学过程的调控。而miR-557在肝癌中的生物学功能尚不清楚。我们首先通过生物学信息学发现miR-557在肝癌中低表达。因此,我们推测miR-557在肝癌的起病和进展中存在重要影响,其在肝癌中的功能和分子机制有待深入探索。据此,本课题首先检测了miR-557在肝癌组织及不同肝癌细胞中的表达水平,分析其与HCC患者临床病理参数及生存的关系;然后运用体内体外实验研究了miR-557对肝癌细胞株生物学行为的影响;再通过生物信息学预测并在实验中验证了miR-557通过靶向抑制RAB10的表达而影响肝癌细胞增殖、体内成瘤、迁移、侵袭、上皮间充质转化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）、克隆形成的能力和影响细胞周期的分布;Wnt/β-catenin信号通路是HCC起病发展中极为重要的一条途径,研究表明许多miRNA影响HCC进展是通过Wnt/β-catenin信号途径实现的,最后我们初步探讨了miR-557能否调控Wnt/β-catenin信号途径。本研究具体包括以下三部分:第一部分:miR-557在HCC中的表达及其与患者临床病理特征及预后关系;第二部分:探讨miR-557对肝癌细胞体内外生物学行为的影响;第三部分:miR-557通过靶向RAB10抑制Wnt/β-catenin信号的研究。第一部分:miR-557在HCC中的表达及其与患者临床病理特征及预后关系目的:探讨miR-557在肝癌中的表达水平及其与患者临床病理特征及预后的关系。方法:1、生物信息学分析miR-557在HCC瘤组织中的表达。2、运用实时荧光定量PCR（Real Time Quantitative PCR,RT-qPCR）检测肝癌组织及对应癌旁非瘤组织中miR-557的表达水平。3、分析miR-557表达水平与HCC患者临床病理参数及生存之间的关系。4、运用RT-qPCR检测HCC细胞株和人正常肝细胞L02中miR-557的表达水平。结果:1、生物信息学分析GSE108724数据集发现,与癌旁非肿瘤组织相比,miR-557在HCC中低表达;分析GSE26323数据集发现,与原位HCC相比,肺转移性HCC中miR-557表达水平更低。2、miR-557在HCC瘤组织中的表达水平显着低于配对的癌旁非瘤组织。3、34例HCC组织标本中,miR-557在低分化患者中的表达水平低于中高分化患者,在>5cm的HCC患者中的表达水平低于≤5cm的HCC患者,在TNM III/IV的HCC患者中的表达水平低于I/II期HCC的患者,在低分化的HCC患者中的表达水平低于高中分化的HCC患者;miR-557低表达的HCC患者的总生存时间更短。4、相比正常肝细胞L02,miR-557在肝癌细胞株MHCC-97H、MHCC-97L、Huh7、Hep G2、SMMC-7721中表达均下调,其中MHCC-97H细胞表达最低,Huh7细胞表达最高。结论:miR-557在肝癌组织及细胞系中均呈低表达,且与患者恶性生物学特征及不良的预后显着相关。第二部分:探讨miR-557对肝癌细胞体内外生物学行为的影响目的:探讨干扰或促进miR-557的表达是否影响肝癌细胞的生物学行为。方法:1、在体外运用miR-557 mimics/mimic-NC或慢病毒Lv-miR-557/Lv-vector转染MHCC-97H细胞,运用inhibitors/inhibitor-NC或Lv-sponge-miR-557/Lvsponge-NC转染Huh7细胞,并用RT-qPCR验证转染效率。2、CCK-8实验、细胞克隆形成实验检测miR-557对HCC细胞增殖潜能的影响;划痕实验、Transwell实验检测miR-557对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响。3、RT-qPCR及蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验检测miR-557对HCC细胞上皮间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响。4、运用流式细胞仪检测miR-557对HCC细胞周期分布的影响。5、裸鼠皮下成瘤实验检测miR-557对HCC细胞体内成瘤潜能的影响。结果:1、运用miR-557 mimics或Lv-miR-557可以显着升高MHCC-97H细胞中miR-557的表达水平,运用inhibitors或Lv-sponge-miR-557可以显着降低Huh7细胞中miR-557的表达水平,细胞可用于下一步实验。2、CCK-8实验、细胞克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验表明,上调miR-557表达后可抑制MHCC-97H细胞的增殖、迁移和侵袭能力,下调miR-557表达后可促进Huh7细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3、与NC组相比,上调miR-557的表达水平后可增加MHCC-97H细胞中E-cadherin的表达而减少N-cadherin和Vimentin的表达;下调Huh7细胞miR-557的表达水平后则出现相反的结果。4、细胞周期实验表明,上调miR-557表达后可使MHCC-97H细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期;下调miR-557可促使Huh7细胞的细胞周期从G0/G1向G2/M过渡。5、体内实验表明,上调miR-557表达后会抑制MHCC-97H细胞在裸鼠皮下成瘤的能力;下调miR-557后使得Huh7细胞的裸鼠皮下成瘤能力进一步加强。结论:上调miR-557的表达会抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮间充质转化、体内生长及诱导细胞周期阻滞在G0/G1期。抑制miR-557的表达则呈相反趋势。第三部分:miR-557通过靶向RAB10抑制Wnt/β-catenin信号的研究目的:探讨miR-557在肝癌中的潜在作用机制及下游信号通路。方法:1、通过在线生物信息学软件Targetscan、miRDB、mi Walk和miRTar Base初步预测了miR-557的靶基因。2、双荧光素酶基因报告实验验证miR-557与RAB10的靶向调控关系。3、在上调miR-557表达的MHCC-97H细胞和下调miR-557表达的Huh7细胞中,运用RT-qPCR和WB实验检测RAB10在m RNA和蛋白表达水平的变化。4、免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）检测肝癌组织及癌旁组织中RAB10蛋白的表达水平,RT-qPCR检测34例HCC患者癌组织和配对癌旁非瘤组织中RAB10 m RNA的表达水平,并分析与miR-557的相关性。5、共转染miR-557 mimics+pc DNA3.1-RAB10或miR-557 inhibitors+si RAB10,分析促进/干扰RAB10的表达能否逆转miR-557 mimics/inhibitors对HCC细胞生物学行为的影响。6、在上调miR-557表达的MHCC-97H细胞和下调miR-557表达的Huh7细胞中,运用WB实验检测Wnt/β-catenin信号通路中重要分子GSK-3β、pGSK-3β、β-catenin、Non-p-β-catenin的变化。7、共转染miR-557 mimics+pc DNA3.1-RAB10或miR-557 inhibitors+si RAB10,运用WB实验检测Wnt/β-catenin信号通路中重要分子GSK-3β、pGSK-3β、β-catenin、Non-p-β-catenin的变化。结果:1、通过生物信息学软件Targetscan、miRDB、mi Walk和miRTar Base初步预测miR-557的靶基因为RAB10。2、双荧光素酶基因报告实验验证了miR-557能够靶向抑制RAB10的表达3、RT-qPCR检测miR-557表达上调的MHCC-97H细胞和miR-557表达下调的Huh7细胞中潜在靶基因的变化,其中RAB10变化显着,WB实验验证了RAB10的变化。4、IHC检测了34例HCC患者癌组织和配对癌旁非瘤组织中RAB10的表达水平,结果提示癌组织中RAB10的表达水平高于癌旁非瘤组织;RT-qPCR得出同样的结果,并与miR-557呈负相关。5、促进/干扰RAB10的表达能部分逆转miR-557 mimics/inhibitors对HCC细胞生物学行为的影响。6、上调miR-557的表达可减少GSK-3β磷酸化、增加β-catenin磷酸化和减少Non-p-β-catenin入核,从而抑制Wnt/β-catenin信号;下调miR-557的表达则出现相反的结果;促进/干扰RAB10的表达能部分逆转miR-557mimics/inhibitors对HCC中Wnt/β-catenin信号的影响。结论:miR-557通过靶向抑制RAB10的表达来调节Wnt/β-catenin信号通路的活性进而影响肝癌细胞的生物学行为。

黄丹萍^[5]（2021）在《复方叶下珠通过自噬降解Caveolin-1促进β-catenin泛素化失稳抑制乙肝相关性肝癌的机制研究》文中研究指明肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）目前仍是严重威胁人类生命健康的重大问题,复发转移是影响其临床疗效的关键环节。复方叶下珠（Compound Phyllanthus urinaria L.,CP）由叶下珠、半枝莲、黄芪、莪术、山慈菇五味中药组成,是深圳市中医院肝病研究中心在长期临床与科研实践总结的经验方,申报国家专利（申请号:201610517509.2）。前期已开展相关临床观察,结果显示CP可延缓乙肝相关性肝癌（HBV-associated HCC）进展,甚至阻止癌细胞的转移,然而,其抗癌与转移作用和机制尚不清楚。本研究发现,CP可显着抑制乙肝相关性肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。网络药理学和生物信息学综合分析乙肝相关性肝癌临床标本,预测Caveolin-1（Cav-1）可能作为CP主要靶点之一,介导其抗转移作用。而Wnt/β-catenin通路是CP抗乙肝相关性HCC的核心机制之一。进一步实验表明,高表达Cav-1细胞株可通过稳定β-catenin促进乙肝相关性肝癌的转移,而CP可诱导Cav-1自噬降解,通过泛素激活Akt/Gsk3 β介导的β-catenin蛋白酶体降解,从而减弱Cav-1的转移促进作用。此外,我们还通过体内和体外实验进一步证实了 CP的抗增殖转移作用。在小鼠肝癌移植和斑马鱼异种移植模型中,我们发现CP均能抑制乙肝相关性肝癌的生长和转移。综上所述,我们的研究不仅强调了CP在抑制乙肝相关性肝癌转移的功能,并进一步探讨了 Cav-1在介导Akt/GSK3 β/β-catenin信号轴调控晚期乙肝相关性肝癌进展中的关键作用。目的:研究复方叶下珠通过自噬降解Caveolin-1促进β-catenin泛素化失稳抑制乙肝相关性肝癌转移的作用和机制。方法:第一部分:CP对乙肝相关性肝癌的增殖表型的作用研究。1、采用不同浓度的 CP 溶液（0、30、60、120、240、300、480、600 μg/ml）干预HepG2,SMMC-7721,Huh-7 3种肝癌细胞,并利用CCK-8、细胞计数、克隆形成实验研究CP对肝癌细胞增殖、克隆形成的作用。2、利用pENTER-URG11质粒转染HepG2构建稳定性乙肝相关性肝癌细胞HepG2-URG11。利用划痕实验,Western blot实验验证乙肝相关性肝癌细胞HepG2-HBx和HepG2-URG11的迁移能力及转移相关蛋白的表达。3、采用不同浓度的CP溶液,干预HepG2-HBx和HepG2-URG11 2种乙肝相关性肝癌细胞,利用CCK-8、克隆形成实验研究CP对乙肝相关性肝癌细胞增殖、克隆形成的影响。第二部分:CP对乙肝相关性肝癌细胞转移能力的作用研究。1、采用不同浓度的CP溶液（0、30、60、120 μg/ml）干顸HepG2-HBx和HepG2-URG112种乙肝相关性肝癌细胞,同时120 μg/ml的CP溶液分别干预2种乙肝相关性肝癌细胞0h,24h,48h,72h,运用划痕实验,Transwell实验和Western blot实验研究CP对乙肝相关性肝癌的迁移侵袭能力和转移相关蛋白标志物的作用。第三部分:CP降低乙肝相关性肝癌中β-catenin蛋白稳定性的研究1、将不同浓度的CP溶液（0、30、60、120 μ g/ml）作用于2种乙肝相关性肝癌细胞,利用120 μ g/ml的CP溶液分别干预乙肝相关性肝癌细胞0 h,24 h,48 h,72 h,采用核质分离实验和Western blot方法研究乙肝相关性肝癌细胞总β-catenin,核β-catenin与胞浆中β-catenin蛋白含量改变2、将不同浓度的CP溶液（0、30、60、120 μ g/ml）作用于2种乙肝相关性肝癌细胞,利用免疫荧光技术标记β-catenin蛋白,采用超高分辨率激光共聚焦显微镜观察CP对乙肝相关性肝癌细胞中β-catenin表达水平和细胞定位的影响。3、将 Proteasome 抑制剂（Mg132 10 μ M）、蛋白合成抑制剂（Cycloheximide,CHX 10 μM）单独或联合CP溶液（120 μ g/ml）干预乙肝相关性肝癌细胞HepG2-HBx,采用Western Blotting实验观察CP对HepG2-HBx细胞中β-catenin蛋白合成和蛋白酶途径降解的影响。4、采用不同浓度CP溶液（0、30、60、120 μ g/ml）作用于2种乙肝相关性肝癌细胞,同时120 μ g/ml的CP溶液分别干预2种乙肝相关性肝癌细胞0h,24h,48h,72h,通过Western Blotting实验观察CP对β-catenin上游调控通路中P-GSK-3β、GSK-3β、P-AKT和AKT蛋白水平的影响;进一步采用GSK-3β抑制剂LiC1（20 μ M）或AKT抑制剂LY294002（LY,25 μM）联合CP溶液（120 μg/ml）作用于乙肝相关性肝癌细胞,通过Western Blotting实验观察CP对乙肝相关性肝癌细胞中β-catenin蛋白表达水平影响。第四部分:CP网络药理学及乙肝相关性肝癌生物信息学研究1、利用在线数据库TCMSP、TCMID查询CP各组分活性成分,筛选符合口服利用度（oral bioavailability,OB）和类药性（drug likeness,DL）条件的候选化合物;使用Cytoscape软件（version 3.2.1）对各药材的成分-目标网络进行可视化。2、使用NCBI GEO数据库获得乙肝相关性肝癌临床病人基因芯片;利用GEO2R软件识别乙肝相关性肝癌差异基因;利用韦恩图获得CP作用于乙肝相关性肝癌靶点;利用String数据库和Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）。3、使用DAVID数据库对乙肝相关性肝癌靶点基因进行富集分析,富集项目包括生物过程（biological process,BP）富集,分子功能（molecular function,MF）富集,细胞组分（cellular component,CC）富集及KEGG通路。第五部分:CP调控乙肝相关性肝癌细胞Cav-1自噬性降解的作用研究1、将不同浓度的CP溶液（0、30、60、120 μ g/ml）作用于2种乙肝相关性肝癌细胞,利用免疫荧光技术标记Cav-1蛋白,采用超高分辨率激光共聚焦显微镜观察CP对乙肝相关性肝癌细胞中Cav-1表达水平和细胞定位的影响。2、将不同浓度的CP溶液（0、30、60、120 μ g/ml）作用于2种乙肝相关性肝癌细胞,同时用120 μ g/ml的CP溶液分别干预乙肝相关性肝癌细胞0h,24h,48h,72h,采用Western blot方法研究乙肝相关性肝癌细胞Cav-1蛋白含量改变。3、为进一步探索CP对Cav-1的干预路径,分别将蛋白降解抑制剂Mg132（10 μM）和自噬抑制剂 CQ（30 μM）与 CP（120 μ g/ml）联用,采用 Western Blotting实验检测乙肝相关性肝癌细胞Cav-1蛋白含量改变。4、采用120 μ g/ml的CP溶液干预HepG2-HBx细胞,利用免疫荧光双染技术标记溶酶体标记物-溶酶体相关膜蛋白1（Lamp1）抗体和Cav-1,超高分辨率激光共聚焦显微镜下观察CP对HepG2-HBx细胞中Cav-1自噬性降解的影响。第六部分:CP通过抑制Cav-1激活Akt/Gsk3 β介导的β-catenin蛋白酶体降解途径的研究1、利用LipoFiterTM脂质体转染试剂将pcDNA 3.1（C）-CAV1质粒转染HepG2-HBx和HepG2-URG11细胞中构建CAV-1稳定高表达的乙肝相关性肝癌细胞系;利用X-tremeGENE siRNA 转染试剂将 pcDNA 3.1（+）-β-catenin 质粒瞬时转染至 Cav-1高表达乙肝相关性肝癌细胞株中构建的β-catenin低表达的HepG2-HBx-Cav-1细胞系。2、采用120 μ g/ml的CP溶液干预乙肝相关性肝癌Cav-1高表达和对照空载细胞株,运用划痕实验观察CP对高表达Cav-1的乙肝相关性肝癌细胞转移能力的影响。3、采用120 μ g/ml的CP溶液干预乙肝相关性肝癌Cav-1高表达细胞系、空载细胞株和空白细胞株,采用Western Blotting实验检测CP对各细胞株中转移相关蛋白 Vimentin,E-cadherin 和 N-cadherin 蛋白水平的影响。4、采用120 μ g/ml的CP溶液干预乙肝相关性肝癌Cav-1高表达细胞系、空载细胞株和空白细胞株,采用Western Blotting实验检测CP对Akt/Gsk3 β/β-catenin信号轴相关蛋白表达量的影响。5、采用120 μ g/ml的CP溶液干预HepG2-HBx-Cav-1细胞系,通过免疫共沉淀和泛素化实验观察CP对乙肝相关性肝癌细胞和高表达Cav-1细胞系中β-catenin泛素化的影响。6、将CP溶液（120 μ g/ml）与GSK-3 β抑制剂LiCl（20 μ M）或AKT抑制剂LY294002（LY,25 μM）联合作用于 HepG2-HBx-Cav-1 细胞株,通过 Western Blotting实验观察CP对乙肝相关性肝癌细胞中β-catenin、Cav-1、P-GSK-3 β、GSK-3β、P-AKT和AKT蛋白表达水平影响。7、采用 CP 溶液（120 μ g/ml）干预已敲低β-catenin 的 HepG2-HBx-Cav-1 细胞系运用划痕实验观察CP对β-catenin干扰后的HepG2-HBx-Cav-1细胞系转移能力的影响。第七部分:体内实验研究CP对乙肝相关性肝癌增殖转移的作用。1、于BALB/C裸鼠右侧肝区皮下注射HepG2-HBx和HepG2-null细胞系,构建裸鼠肝癌及乙肝相关性癌皮下肿瘤模型,不同浓度CP溶液（0、300、625 mg/kg）给药,观察瘤体大小变化;采用HE染色法观察裸鼠肺部转移灶数量。2、将HepG2-HBx细胞通过显微注射技术植入斑马鱼腹中构建斑马鱼乙肝相关性肝癌异种移植模型,采用不同浓度CP溶液（0、60、120 μ g/ml）作用于斑马鱼,利用Dil染色观察CP对肿瘤增殖和转移的影响;通过HE染色法进一步观察肿瘤大小变化;利用免疫组化实验观察CP对斑马鱼体内肿瘤的Cav-1、β-catenin、Vimentin和E-cadherin蛋白表达的影响。结果:第一部分:CP抑制肝癌细胞及乙肝相关性肝癌细胞的增殖能力。1、CP显着抑制HepG2,SMMC-7721,Huh-7 3种肝癌细胞的增殖活力和克隆形成能力,具有时间和剂量依赖性。2、CP对普通肝癌细胞HL-7702无明显毒副作用。3、成功构建HepG2-URG11细胞株;HepG2-HBx和HepG2-URG11 2种乙肝相关性肝癌细胞株比普通肝癌细胞株具有更强的增殖和迁移能力。EMT相关蛋白标志物发生明显改变。第二部分:CP抑制乙肝相关性肝癌的迁移侵袭能力。1、CP可抑制乙肝相关性肝癌细胞的伤口愈合能力和小室穿透能力。2、CP干预可影响乙肝相关性肝癌细胞EMT相关蛋白的表达,表现为Vimentin,N-cadherin蛋白的降低和E-cadherin的上升。第三部分:CP降低乙肝相关性肝癌中β-catenin蛋白稳定性。1、CP降低乙肝相关性肝癌细胞HepG2-HBx和HepG2-URG11中总β-catenin,核β-catenin 和胞浆 β-catenin 的表达。2、CP抑制乙肝相关性肝癌细胞HepG2-HBx和HepG2-URG11中β-catenin的核易位。3、CP通过蛋白酶体降解途径促进HepG2-HBx中β-catenin的降解。4、CP通过Akt/GSK3 β信号通路促进β-catenin的降解。第四部分:构建CP“成分-靶点 乙肝相关性肝癌疾病”作用网络。1、从数据库中筛选出CP各组分共76个潜在活性物质。2、交集分析得到181个CP对乙肝相关性肝癌的作用靶点,其中CAV-1是CP的核心靶点之一。3、富集分析提示CP作用靶点与多种细胞生物学功能相关,Wnt通路可能参与CP对乙肝相关性肝癌的抑制作用。第五部分:CP促进乙肝相关性肝癌细胞Cav-1自噬性降解。1、CP降低乙肝相关性肝癌细胞中Cav-1蛋白的表达,呈时间和剂量依赖性。2、CP可促进乙肝相关性肝癌细胞的自噬水平,通过自噬性降解途径促进Cav-1降解。第六部分:CP通过抑制Cav-1激活Akt/Gsk3 β介导的β-catenin蛋白酶体降解途径。1、CP可逆转Cav-1对乙肝相关性肝癌细胞迁移能力的促进作用。2、CP可逆转Cav-1对乙肝相关性肝癌细胞转移相关蛋白的调节作用。3、CP可干扰Cav-1对乙肝相关性肝癌细胞Akt/Gsk3 β/β-catenin信号轴的调控作用。4、CP可抵消Cav-1对乙肝相关性肝癌细胞β-catenin分布的影响。5、Cav-1过表达可逆转CP诱导的β-catenin降解,导致β-catenin积累。6、CP促进乙肝相关性肝癌细胞中β-catenin的泛素化积累。7、β-catenin敲低可抵消Cav-1对乙肝相关性肝癌细胞迁移能力的促进作用。第七部分:CP裸鼠和斑马鱼乳腺癌异种移植模型中乙肝相关性肝癌的生长和转移能力。1、CP显着抑制裸鼠体内肿瘤的生长和肺部转移灶的形成。2、CP有效抑制斑马鱼异种移植模型肿瘤的生长和扩散;显着降低了肿瘤中Cav-1、β-catenin、Vimentin 和 E-cadherin 的蛋白表达。结论:1、CP在体内和体外均能有效地抑制乙肝相关性肝癌的生长和转移;2、利用网络药理学方法,通过搜索现有的公共数据库和系统分析,鉴定出181个与CP和乙肝相关性肝癌密切相关的潜在基因。其中,CAV-1被认为是核心功能基因之一。通路富集分析提示,Wnt/β-catenin信号通路参与了乙肝相关性肝癌进展过程中CP的抗癌和抗转移机制;3、机制研究发现,CP通过自噬途径降解Cav-1,导致β-catenin泛素化失稳,进而发挥抗乙肝相关性肝癌转移的作用。

刘皎皎^[6]（2021）在《“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究》文中提出目的:采用随机对照临床试验（RCT）方法观察“补肾生髓成肝”法治疗晚期肝癌的临床疗效,并探究其改善肝癌肝再生微环境的疗效机制,为临床推广应用提供较高级别的循证医学证据。方法:1.采用随机分组法将2017年1月至2020年6月就诊于陕西省中医医院肝病科的入选晚期肝癌患者共126例,基于随机数字表法简单随机分成3组,即西医对照组42例（以下简称西医组）,采用西医综合治疗方案;补肾生髓成肝单独治疗组42例（以下简称中医组）,采用地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减治疗方案;补肾生髓成肝综合治疗组42例（以下简称中西医组）,采用西医治疗组方案基础上加上地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减。入选后有10例患者脱落（中医组6例,3例因失访脱落,3例因不能坚持治疗脱落;西医组4例,2例因异地就医不便退出,2例因不能坚持治疗脱落）,最终纳入统计分析病例资料的共116例,西医对照组（西医组）38例、补肾生髓成肝综合治疗组（中西医组）42组、补肾生髓成肝单独治疗组（中医组）36例。该研究通过湖北省中医院伦理审查,在中国临床试验注册中心（世界卫生组织国际临床试验平台一级注册机构）完成临床试验注册,注册号:Chi CTR-IOR-17011439。参与研究的患者均自愿签署了知情同意书。对比三组治疗3个月及治疗6个月的生存率及生存期,对比治疗前、治疗后3个月血常规、粪常规加潜血、肝功、血糖、血脂、肾功等指标,对比三组治疗前后的中医证候评分、生存质量评分,并对患者生存期的独立影响因素进行分析。2.依据治疗方案治疗3个月后分别收集中医组、西医组、中西组每组20名患者血清,共60份,正常人群血清18份。收集的血清-80℃冻存于陕西省中医医院肝病实验室。通过悬液芯片系统检测患者血清肝再生相关细胞因子粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony Factor,G-CSF）、肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白介素-6/8/18（Interleukin-6,IL-6,Interleukin-8,IL-8,Interleukin-18,IL-18）、血小板源性生长因子（Platelet Derived Growth Factor,PDGF-BB）、干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Nnecrosis Factor-α,TNF-α）的含量,观察体现“补肾生髓成肝”的中药对这些细胞因子的影响。结果:（1）三组患者治疗前后生存率及生存期比较:治疗3个月及6个月后,中西医组、中医组和西医组生存率比较,有统计学差异（88.10%VS72.22%VS52.63%）、（71.43%VS58.33%VS34.21%）（P<0.05）。治疗后中西医组、中西组和西医组患者生存期比较,具有统计学差异（23.86±17.55VS20.08±19.86VS15.95±16.44）（P<0.05）。（2）三组患者治疗前后肿瘤大小比较:中西医组、中医组和西医组组间比较及前后测量时间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。（3）三组患者治疗前后肝功指标比较:中西医组患者治疗后直接胆红素水平、间接胆红素水平、谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶水平较治疗前显着降低（P<0.05）,组间比较无统计学差异（P>0.05）。中医组治疗后胆碱酯酶水平较治疗前显着升高,组间比较不具有统计学意义（P>0.05）。三组患者治疗前后白蛋白水平比较,具有统计学意义（P<0.05）;两两比较,中西医组及中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（4）三组患者治疗前后其他生化指标比较:三组患者治疗后血常规指标中白细胞水平、中性粒细胞/淋巴细胞比值、血小板水平,中西医组、中医组与西医组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后肌酐水平比较,中西医组、中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（5）三组患者治疗前后中医证候评分比较:三组患者治疗前后中医证候评分以时间因素为源的主体内差异及以组别为源的主体间效应,具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后的中医证候评分均显着低于治疗前,差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组显着低于西医组的中医证候评分,差异具有统计学意义（P<0.05）。（6）三组患者治疗前后生存量表积分比较:三组患者生理机能积分方面治疗后积分均显着高于治疗前,具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组与西医组的社会功能评分比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。三组患者在生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,有统计学意义（P<0.05）,且两两组间比较后中西医组与中医组、西医组的生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）HGF表达水平比较:西医组明显高于中西医组、中医组及正常人群组,差异具有统计学意（2255.17VS1097.76VS1072.39VS882.67）（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制HGF的过度表达。（8）IL-6表达水平比较:中医组、中西医组及西医组均低于正常人群组,且组间差异具有统计学意义（5638.03VS5166.45VS12842.5VS24559.34）（P<0.05）。中西医组、中医组IL-6表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制IL-6的过度表达。（9）IL-18表达水平比较:西医组、中西医组及中医组,比较差异不具有统计学意义（120.345VS82.61VS78.58）（P>0.05）,但均较正常人群组升高（75.165）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗同样可以促进IL-18的表达。（10）PDGF-BB表达水平比较:中医组相对中西医组、西医组降低,差异不具有统计学意义（4677.18VS6140.6VS5534.885）（P>0.05）。但中医组低于西医组及中西医组,且更接近正常人群组（4401.67）。提示单用“补肾生髓成肝”可以抑制PDGF-BB的过度表达。（11）TNF-α表达水平比较:西医组、中西医组、中医组及正常人群组比较差异具有统计学意义（735.955VS244.93VS573.46VS1037.25）（P>0.05）。中西医组TNF-α表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”可以更好的抑制TNF-α的过度表达。结论:“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌能够显着提高晚期肝癌患者3个月及6个月的生存率及生存期,改善晚期肝癌患者临床症状同时,改善患者各种生化指标。明显降低晚期肝癌患者的中医证候评分,提高患者的生存质量,为临床推广应用提供了较高级别的循证医学证据。“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌患者的疗效机制之一可能是通过抑制晚期肝癌患者HGF、PDGF-BB、TNF-α、IL-6的过度表达,同时升高晚期肝癌患者IL-18的表达,改善肝癌的肝再生微环境及其相关的炎症微环境、免疫微环境、血管新生微环境等。

曹献^[7]（2021）在《肝宁方对小鼠肝癌癌前病变炎症微环境影响的实验研究》文中研究指明目的:肝宁方在实际临床应用中,对肝病患者具有良好的治疗效果,具有研究价值和意义,本研究目的是通过研究肝宁方对二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine,DEN）联合四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）诱导建立原发性肝癌癌前病变小鼠模型炎症微环境的影响,以期阐明肝宁方对肝癌癌前病变的防治作用机制。方法:60只周龄6-8周,重量为（18±22）g的KM雄性小鼠,适应性饲养一周后,随机分为四组（15只）:对照组、模型组、肝宁方组、护肝片组。除对照组,其余各组进行CCl4溶液灌胃和DEN腹腔注射联合造模,同时每天进行药物灌胃。于16周末（肝癌癌前病变期）将小鼠进行禁食取材,眼眶采血,摘取脾脏、肝脏。记录各组间肝的外观、癌前结节的数目及大小;称量肝脏、脾脏、体重;检测小鼠血清肝功能ALT、AST、GGT、TBIL水平;肝脏病理检查;酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测血清中小鼠血清IL-6、IL-1β、AFP、TNF-α、GPC-3、TSGF和Ki67含量;蛋白质印迹法（Western Blot,WB）检测TLR4、NF-κB蛋白表达。结果:1.一般情况:与对照组相比,模型组、肝宁方组、护肝片组在造模第4周开始出现进食量减少,精神萎靡,掉毛,急躁易怒等表现,第8周部分出现腹水,尾部出现皮下出血点,行动迟缓。与模型组相比,肝宁方组和护肝片组程度均好于模型组,一般状态好。2.体重指数:与对照组相比,模型组、肝宁方组、护肝片组体重显着下降（P<0.01）;与模型组相比,肝宁方组、护肝片组体重显着增加（P<0.05）;肝脏指数、脾脏指数:与对照组相比,模型组、肝宁方组、护肝片组肝脏指数和脾脏指数显着增加（P<0.01）,与模型组相比,肝宁方组肝脏指数和脾脏指数显着下降（P<0.01）,护肝片组肝脏指数和脾脏指数下降（P<0.05）。3.病理:小鼠肝脏形态,模型组小鼠肝脏组织质地粗糙,色泽暗沉,表面密布大小不等白色增生结节（0.2-3cm）肉眼可见,与模型组相比,肝宁方组和护肝片组,结节分布密度低,直径小,肝脏色泽较好。肝组织HE染色,模型组小鼠肝细胞出现水肿、坏死,成巢状,细胞核出现核异型性（核大、双核、多核）,细胞密度增高,汇管区间质增生,纤维组织增多;结节包膜明显,与周边肝脏组织界限清楚,肝小梁结构不规则。与模型组相比,肝宁方组细胞变性坏死程度轻,纤维组织增生程度较轻,细胞较少出现核异型,护肝片介于两者间。4.肝功能:与对照组相比,模型组、肝宁方组、护肝片组肝功能ALT、AST、GGT、TBIL显着升高（P<0.01）,与模模型组相比,肝宁方组肝功能ALT、AST、GGT、TBIL显着降低（P<0.01）,护肝片组肝功能ALT、AST、GGT、TBIL降低（P<0.05）。5.炎症因子:与对照组相比模型组、肝宁方组、护肝片组IL-6、IL-1β、TNF-α显着升高（P<0.01）,与模型组相比肝宁方组IL-6、IL-1β、TNF-α水平显着降低（P<0.01）,护肝片组IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低（P<0.05）。6.肿瘤相关因子:与对照组相比模型组、肝宁方组、护肝片组AFP、GPC-3、TSGF和Ki67显着增高（P<0.01）,与模型组相比肝宁方组、护肝片组AFP、GPC-3、TSGF和Ki67显着降低（P<0.05）。7.与对照组相比模型组、肝宁方组、护肝片组TLR4、NF-κB蛋白表达显着增加（P<0.01）,与模型组相比,肝宁方和护肝片组TLR4、NF-κB蛋白表达显着下降（P<0.05）。结论:1.肝宁方对DEN诱导的小鼠肝癌癌前病变有抑制作用2.肝宁方可抑制TLR4、NF-κB的表达,改善肝癌癌前病变的炎症微环境,其可能通过TLR4/NF-KB信号通路发生作用。

银艳桃^[8]（2021）在《参灵方对原发性肝癌患者肝动脉化疗栓塞术后免疫功能的影响》文中指出目的:探讨参灵方对原发性肝癌患者肝动脉化疗栓塞术后免疫功能的影响,为改善原发性肝癌患者免疫功能提供临床参考。方法:将60例原发性肝癌患者,采用随机数字表法进行随机分组,将其分为对照组和治疗组两组,每组人数各30例。对照组行TACE术治疗,术后予常规西医对症治疗;治疗组在对照组治疗方案基础上服用参灵方。两组疗程均为1个月。分别于治疗前、后记录患者T淋巴细胞、NK细胞、体液免疫、细胞因子、肝功能、血清甲胎蛋白（AFP）等观察指标的水平以及中医证候积分、中医总疗效、实体瘤疗效结果,并将所有结果进行比较分析。结果:1.细胞免疫水平比较:两组治疗后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及NK细胞水平均较治疗前上升（P<0.05）;两组治疗后CD8+水平均较治疗前降低（P<0.05）。治疗后两组间比较,治疗组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及NK细胞水平显着高于同期对照组（P<0.05）;治疗后两组间比较,治疗组CD8+水平显着低于同期对照组（P<0.05）;2.体液免疫水平比较:两组治疗后Ig A、Ig G、Ig M水平均较治疗前升高（P<0.05）;治疗后两组间比较,治疗组Ig A、Ig G、Ig M水平显着高于同期对照组（P<0.05）;3.细胞因子水平比较:两组治疗后IL-2、IFN-γ水平均较治疗前上升（P<0.05）;治疗后两组间比较,治疗组IL-2、IFN-γ水平显着高于同期对照组（P<0.05）。两组治疗后IL-4、IL-6、l L-10水平均较治疗前降低（P<0.05）;治疗后两组间比较,治疗组IL-4、IL-6、l L-10水平显着低于同期对照组（P<0.05）;4.肝功能水平比较:两组治疗后血清TBIL、AST、ALT水平均较治疗前降低（P<0.05）。治疗后两组间比较,治疗组血清TBIL、AST、ALT水平显着低于同期对照组（P<0.05）;5.AFP水平比较:两组治疗后血清AFP水平均较治疗前降低（P<0.05）;治疗后两组间比较,治疗组血清AFP水平显着低于同期对照组（P<0.05）;6.实体瘤疗效:两组治疗后对照组总有效率76.67%,治疗组总有效率83.33%,两组比较,无显着统计学差异（P>0.05）;7.中医证候积分及总疗效:两组患者治疗后胁痛、乏力、纳呆、腰膝酸软、恶心、畏寒证候积分均较治疗前降低（P<0.05）;治疗后两组间比较,治疗组各证候积分显着低于同期对照组（P<0.05）;两组患者比较,对照组中医疗效总有效率为66.67%;治疗组中医疗效总有效率为90%,治疗组总有效率显着高于对照组（P<0.05）。结论:1.参灵方能显着提升原发性肝癌患者TACE术后细胞免疫水平,改善患者细胞免疫功能;2.参灵方能显着提升原发性肝癌患者TACE术后体液免疫水平,改善患者体液免疫功能;3.参灵方能显着改善原发性肝癌患者TACE术后肝功能、抑制AFP表达,减轻肝脏损害,抑制肿瘤生长;4.参灵方能显着改善原发性肝癌患者TACE术后中医证候积分及总疗效,提临床效果。

蒋锐沅^[9]（2021）在《敷和备化方联合TACE术治疗原发性肝癌临床疗效及对血清CHI3L1、IL-6、IL-8等炎症因子影响的观察》文中研究指明目的:通过文献计量学的方法分析出原发性肝癌相关的炎症因子,以数据挖掘技术证实敷和备化方中的中药均为各名老中医治疗肝郁脾虚型原发性肝癌的高频药物,以网络药理学技术证实敷和备化方中的中药治疗原发性肝癌的作用机制是通过改善原发性肝癌相关炎症微环境实现的,以临床前瞻性研究的方法观察敷和备化方联合肝动脉化疗栓塞术治疗中晚期不可手术的肝郁脾虚型HCC患者的近期疗效、生活质量评分、术后栓塞综合征情况等相关临床疗效指标、安全性指标并观察对原发性肝癌相关炎症因子改善情况。方法:1、以中国知网等中文数据库中收录的对原发性肝癌相关炎症微环境的相关文献作为研究对象,采用文献计量学的方法解析与原发性肝癌关系密切的炎症因子,并以此作为临床研究的靶点。2、采集中国知网等中文数据库中治疗肝郁脾虚型原发性肝癌及原发性肝癌化疗栓塞术后的相关中药方剂,采用数据挖掘的方法分析中国知网等中文数据库中治疗肝郁脾虚型原发性肝癌及原发性肝癌化疗栓塞术的高频中药、中药配伍规律等。3、采用网络药理学的方法分析敷和备化方中治疗原发性肝癌的作为靶点,证实敷和备化方中的中药能够通过改善肝癌炎症微环境的方式治疗原发性肝癌。4、按照纳入标准,选取90例2019年1月至2019年12月间在广西中医药大学第一附属医院肿瘤科及肝病科住院治疗,证型属于肝郁脾虚证并行肝动脉化疗栓塞术治疗的患者,采用随机对照临床试验研究方法,将90例患者随机分为治疗组和对照组,每组各45例,治疗组予敷和备化方联合肝动脉化疗栓塞术治疗,对照组单用肝动脉化疗栓塞术治疗。观察对比两组患者的近期疗效情况、术后栓塞综合征情况、中医证候积分、无进展生存期、血清甲胎蛋白水平、血清肝纤四项水平、FACT-Hep肝胆肿瘤治疗功能评分等近期疗效指标及血清白细胞介素-2、白细胞介素-6等血清炎症因子指标变化情况。结果:1、通过文献计量学的研究方法发现,目前在原发性肝癌相关的炎症因子中,较为热门且关系密切的炎症因子为白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-12、肿瘤坏死因子-α,目前的体外实验及体验实验均以这些靶点作为主要的研究对象。2、共计收集到153篇中国知网等中文数据库中治疗肝郁脾虚型原发性肝癌及原发性肝癌化疗栓塞术后的相关中药方剂,共计涉及203味中药,使用频次前10味的中药分别是柴胡、白术、白芍、枳实、当归、鳖甲、莪术、甘草、半夏、香附均为敷和备化方中的药物;使用频率前5的药对分为是柴胡—白术、柴胡—白芍、白术—白芍、白芍—当归、白芍—鳖甲;置信度排名前5的药物关联组合为柴胡—白术→白芍、白术—茯苓→白芍、柴胡—白芍→鳖甲、枳实—白芍→党参、枳实—莪术→鳖甲,分析所得数据均与敷和备化方的方剂配伍、药物组成基本相同。3、通过以敷和备化方中的17味中药作为研究对象,应用网络药理学的方法对敷和备化方中药物的有效成分与原发性肝癌的作用靶点相匹配,共匹配到57个潜在靶点,其中部分靶点为白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-12或其上游蛋白。因此,敷和备化方治疗原发性肝癌的作用机制可能是通过改善炎症微环境中的白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-12等炎症因子表达水平实现的。4、两组患者在术前1天的年龄、性别、TNM分期、肝功能分级、有无乙肝、有无血管侵犯、有无动脉静脉瘘等基线资料相比无明显差异（P>0.05）。（1）近期疗效情况:治疗组患者的客观缓解率为43.4%,疾病控制率为86.7%;对照组患者客观缓解率为32.2%,疾病控制率88.9%为88.9%,两组患者的客观缓解率差异有统计学意义（P<0.05）。（2）术后栓塞综合征情况:两组患者术后未发生严重或致死的栓塞综合征案例,治疗组患者的发热、胃肠道反应、一过性肝功能损害的发生率均显着低于对照组（P<0.05）。（3）血清肝纤四项及甲胎蛋白水平:两组患者术后3月的血清肝纤四项及甲胎蛋白表达水平均较前显着降低（P<0.05）;且治疗组术后3月血清肝纤四项及甲胎蛋白表达水平均较同期对照组显着降低（P<0.05）。（4）FACT-Hep肝胆肿瘤治疗功能评分情况:两组患者术后3月的生理领域、心理领域、社会领域、功能领域、肿瘤领域及总积分均较术前1天显着降低（P<0.05）;且治疗组术后3月生理领域、心理领域、社会领域、功能领域、肿瘤领域及总积分较同期对照组显着降低（P<0.05）。（5）中医证候积分:两组患者术后3月的各项肝郁脾虚相关中医证候积分及总积分均较术前1天有显着降低（P<0.05）;且治疗组患者术后的肝郁脾虚相关中医证候积分及总积分均较同期对照组降低更显着（P<0.05）。（6）无进展生存时间及治疗失败时间:治疗组中位PFS为6.2[95%CI（2.5,4.6）]个月;对照组中位PFS为4.2[95%CI（3.9,7.8）]个月。治疗组TTUP为14.2[95%CI（11.9,15.3）]个月,对照组TTUP为13.7[95%CI（12.8,14.2）]个月。两组患者无进展生存时间具有统计学差异（P<0.05）,治疗失败时间差异无统计学意义（P>0.05）。（7）血清炎症因子水平情况:两组患者术后血清白细胞介素-2、血清白细胞介素-12水平均较术前1天显着提高（P<0.05）,血清白细胞介素-6、白细胞介素-8、血清肿瘤坏死因子-α及血清壳多糖酶3样蛋白1均较术前1天显着减低（P<0.05）;且与同期对照组相比,治疗组术后3月的血清白细胞介素-2水平提高更显着（P<0.05）,血清血清白细胞介素-6、血清白细胞介素-8、血清白细胞介素-12、血清肿瘤坏死因子-α及血清壳多糖酶3样蛋白1降低更显着（P<0.05）。结论:1、通过文献计量学研究发现,原发性肝癌相关的炎症微环境中研究较为热门的炎症因子为白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-12及肿瘤坏死因子-α,并以此为靶点开展中医药改善原发性肝癌炎症微环境的相关实验研究。2、通过数据挖掘研究发现,治疗肝郁脾虚型肝癌及原发性肝癌化疗栓塞术的药物主要以健脾疏肝、清热利湿、化瘀解毒为根本大法,在组方时采用核心药对能够实现提高临床疗效的目的。3、通过网络药理学研究发现,敷和备化方中的相关中药能够通过对白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-12等炎症因子及其上游蛋白的治疗效果达到改善原发性肝癌炎症微环境的目的,实现对原发性肝癌的治疗效果。4、敷和备化方联合肝动脉化疗栓塞术治疗中晚期不可手术的原发性肝癌能够有效提高客观缓解率,改善患者的中医症状,降低FACT-Hep肝胆肿瘤治疗功能评分,减少术后栓塞综合征的发生情况,降低血清肝纤四项及甲胎蛋白水平,改善血清白细胞介素-2、血清白细胞介素-6、血清白细胞介素-8、血清白细胞介素-12、血清肿瘤坏死因子-α及血清壳多糖酶3样蛋白1的表达水平,具有较高的临床疗效和应用前景。

朱晓燃^[10]（2021）在《清肝化瘀颗粒对原发性肝癌大鼠的治疗作用及主要成分对肝癌细胞增殖凋亡的影响》文中提出背景与目的清肝化瘀颗粒是基于姚树坤教授结合中医理论与多年临证经验总结的清肝化瘀方,经完善优化后的现代制剂技术制备而成的颗粒制剂（课题来源于“十二五”“重大新药创制”科技重大专项和北京市科委G20 工程创新研究）,以清热解毒、破瘀散结、健脾益气为治则治法,可针对大多数肝癌患者的证型。前期临床研究与基础实验证实,清肝化瘀方对缓解肝癌患者临床症状、改善生存质量、延长生存期以及提高免疫功能方面具有显着作用,并可以通过多靶点分子,多信号通路对肝癌的多种细胞生物学行为进行调节,深入开发研究价值。苦参是本研究清肝化瘀颗粒的君药之一,其提取物苦参碱单体明确,药理作用广泛,也是清肝化瘀颗粒的主要组分。因此本研究的目的是观察清肝化瘀颗粒对原发性肝癌（Primary liver carcinoma）大鼠的治疗作用,评价其药效学,通过体内凋亡实验和体外细胞实验,初步探究其靶点及作用机制,为临床推广提供理论依据。方法:SPF级雄性6周龄大鼠192只,适应性饲养5天后,造模组（n=180）采用改良后的造模方法,使用二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine,DEN）诱导肝癌,空白组（n=12）给予等体积生理盐水,取材观察肝脏成癌率>80%时开始干预。将造模组大鼠162只（除去死亡3只和观察不同时间成癌率15只）随机分为模型组、清肝化瘀颗粒低剂量组、清肝化瘀颗粒高剂量组、清肝化瘀颗粒高剂量组、肝复乐组和氟尿嘧啶组,每组各27只。清肝化瘀颗粒低、中、高剂量组分别灌胃清肝化瘀颗粒0.47g/kg、0.93g/kg、1.86g/kg,肝复乐组灌胃肝复乐胶囊0.94g/kg,模型组以10ml/kg灌胃等体积生理盐水,氟尿嘧啶组给予氟尿嘧啶注射液20mg/kg腹腔注射,连续给药8周,于末次给药后每组随机选取6只解剖取材。观察指标包括:造模情况及各组大鼠肝脏大体情况、生存期、肝指数、脾指数及肝脏病理组织变化;丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate transaminase,AST）、总胆红素（Total bilirubin,TBIL）、γ-谷氨酰转肽酶（Glutamyl transpeptidase,GGT）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）、α-L-岩藻糖苷酶（Alpha-L-fucosidase,AFU）等肝功能指标;肝癌特异性标志物甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）;通过流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群;原位末端转移酶标记技术（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL）法检测肝癌组织细胞凋亡情况,免疫组化法检测肝癌组织中Caspase-3的表达。选择清肝化瘀颗粒主要成分苦参碱进行体外细胞实验,用CCK8法（cell counting kit-8）检测苦参碱对人肝癌细胞HepG2细胞的增殖抑制作用,筛选出IC50;定量聚合酶链式反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction,QPCR）检测苦参碱对 HepG2 细胞中 Bax、Bcl-2、P53、Beclinl的基因表达的影响。结果1 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠的治疗作用1.1 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠肝脏大体、肝脾指数及生存期的作用①肝脏表面癌结节数:与模型组比较,清肝化瘀颗粒中剂量组、高剂量组和氟尿嘧啶组肝脏表面癌结节数均显着降低。②肝、脾指数:与模型组比较,清肝化瘀颗粒低剂量组、中剂量组和高剂量组、肝复乐组及氟尿嘧啶组的大鼠肝指数均显着降低,且清肝化瘀颗粒低剂量组和氟尿嘧啶组的脾指数亦显着降低。③生存期:给药干预8周后,上述各组 PLC 大鼠的存活率分别为 47.62%、52.38%、71.43%、66.67%、52.38%和 85.71%,中位生存期分别为55d、59d、66d、71d、58d和73d。与模型组相比,清肝化瘀颗粒中、高剂量组和氟尿嘧啶组生存期显着延长;与肝复乐组比较,清肝化瘀颗粒高剂量组的生存期显着延长。1.2 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠肿瘤标志物AFP的下调作用与模型组比较,清肝化瘀颗粒低剂量、中剂量、高剂量组、肝复乐组和氟尿嘧啶组大鼠的AFP水平均显着下降;随着清肝化瘀颗粒组给药剂量的增加,AFP水平呈递减趋势,且清肝化瘀颗粒高剂量组与低剂量组间差异显着。1.3 清肝化瘀颗粒缓解PLC大鼠肝损伤,改善其肝功能的作用与模型组比较,清肝化瘀颗粒高剂量组、氟尿嘧啶组可显着下调AST水平,清肝化瘀颗粒低剂量、中剂量、高剂量组和氟尿嘧啶组均可显着下调血清GGT、AFU、TBIL水平,清肝化瘀颗粒中剂量、高剂量组和氟尿嘧啶组亦可显着下调ALP水平。1.4 清肝化瘀颗粒对PLC大鼠外周血T淋巴细胞的调节作用与模型组比较,清肝化瘀颗粒低剂量、中剂量、高剂量组的CD4+细胞数显着上升,CD8+细胞数显着下降,CD4+/CD8+的比率显着升高。2清肝化瘀颗粒对PLC大鼠肝癌细胞凋亡的影响与模型组相比,清肝化瘀颗粒组的PLC大鼠发生肝癌凋亡的肝癌细胞数量和比例明显增加,Caspase-3在清肝化瘀颗粒剂量组、肝复乐组和氟尿嘧啶组显着表达,且清肝化瘀颗粒低剂量、中剂量、高剂量组间Caspase-3的表达差异显着。3苦参碱对人肝癌细胞HepG2细胞增殖抑制的影响①苦参碱对HepG2细胞活性的影响苦参碱干预24-72小时,HepG2细胞活性显着下降,且苦参碱对肝癌细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性。给药24h、48h、72h后,IC50分别为2.116mg/mL、0.989mg/mL和 1.121mg/mL。②苦参碱以0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL干预HepG2细胞48h,与对照组比较,HepG2细胞Beclin1的表达水平显着下降,且呈浓度依赖性,Bcl-2的表达水平呈不同程度的下降,1.5mg/mL苦参碱可显着下调Bcl-2的表达水平,Bax和P53的表达水平较对照组均有不同程度上升。结论:清热解毒、破瘀散结、健脾益气的清肝化瘀颗粒可有效达到对PLC大鼠的治疗作用,显着延长生存期,其机制可能与通过上调Caspase-3的表达诱导肝癌细胞凋亡起到抗肝癌作用有关。体外实验中清肝化瘀颗粒主要成分苦参碱可通过下调Bcl-2、Beclin1的表达,上调Bax、P53的表达,抑制肝癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,调控细胞自噬。

二、原发性肝癌的体内基因治疗研究与进展（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、原发性肝癌的体内基因治疗研究与进展（论文提纲范文）

（1）856例少数民族地区中晚期原发性肝癌临床特征分析（论文提纲范文）

（2）芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究（论文提纲范文）

（3）基于新型网络药理学策略解析复方苦参注射液抗肝癌主要药效成分与作用机制（论文提纲范文）

（4）miR-557通过靶向RAB10调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌进展的机制研究（论文提纲范文）

（5）复方叶下珠通过自噬降解Caveolin-1促进β-catenin泛素化失稳抑制乙肝相关性肝癌的机制研究（论文提纲范文）

（6）“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究（论文提纲范文）

（7）肝宁方对小鼠肝癌癌前病变炎症微环境影响的实验研究（论文提纲范文）

（8）参灵方对原发性肝癌患者肝动脉化疗栓塞术后免疫功能的影响（论文提纲范文）

（9）敷和备化方联合TACE术治疗原发性肝癌临床疗效及对血清CHI3L1、IL-6、IL-8等炎症因子影响的观察（论文提纲范文）

（10）清肝化瘀颗粒对原发性肝癌大鼠的治疗作用及主要成分对肝癌细胞增殖凋亡的影响（论文提纲范文）

四、原发性肝癌的体内基因治疗研究与进展（论文参考文献）

• [1]856例少数民族地区中晚期原发性肝癌临床特征分析[D]. 倪彩菊. 右江民族医学院, 2021(01)
• [2]芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究[D]. 孙新锋. 广州中医药大学, 2021(02)
• [3]基于新型网络药理学策略解析复方苦参注射液抗肝癌主要药效成分与作用机制[D]. 王珂欣. 山西大学, 2021(01)
• [4]miR-557通过靶向RAB10调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌进展的机制研究[D]. 叶善平. 南昌大学, 2021(01)
• [5]复方叶下珠通过自噬降解Caveolin-1促进β-catenin泛素化失稳抑制乙肝相关性肝癌的机制研究[D]. 黄丹萍. 广州中医药大学, 2021(02)
• [6]“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究[D]. 刘皎皎. 湖北中医药大学, 2021
• [7]肝宁方对小鼠肝癌癌前病变炎症微环境影响的实验研究[D]. 曹献. 广西中医药大学, 2021(01)
• [8]参灵方对原发性肝癌患者肝动脉化疗栓塞术后免疫功能的影响[D]. 银艳桃. 广西中医药大学, 2021(02)
• [9]敷和备化方联合TACE术治疗原发性肝癌临床疗效及对血清CHI3L1、IL-6、IL-8等炎症因子影响的观察[D]. 蒋锐沅. 广西中医药大学, 2021(02)
• [10]清肝化瘀颗粒对原发性肝癌大鼠的治疗作用及主要成分对肝癌细胞增殖凋亡的影响[D]. 朱晓燃. 北京中医药大学, 2021