张俊霞,王利[1]（2021）在《植物口服疫苗的研究进展》文中认为植物口服疫苗是通过转基因植物生产,通过口服的方式预防疾病的生物制品。作为一种新型疫苗,其研究开始于三十几年前。由于植物口服疫苗可以最大程度地降低传统疫苗的潜在风险,在疫苗生产中具有优势,因此拥有良好的商业生产前景。植物疫苗价格低廉,生产过程安全,可产生与注射疫苗相似效价效果,无论是在控制养殖业抗生素滥用的情况下作为替代方法,还是在某些经济发展水平不高、卫生条件较差的发展中国家用于预防和控制某些传染病,都是十分理想的。该文对植物口服疫苗生产方法、候选生物反应器、疫苗有效性、适用范围和发展前景进行了概述。此外,还着重对目前开展的植物口服疫苗在病毒、细菌、寄生虫引起的人畜共患病中的应用研究,以及其在人类肿瘤预防中所开展的应用研究进行了较为详细的综述。虽然植物疫苗的研究及应用在植物外源基因表达量、免疫剂量、免疫接种途径等方面还存在很多挑战,但依然为传统疫苗学的研发提供了一条充满希望的新途径。
苏昕[2]（2011）在《苜蓿和大豆高效表达蛋白质相关特异性启动子的克隆与功能研究》文中研究说明转基因植物能作为一种廉价、方便、安全的生物反应器大量生产重组蛋白。在过去的十几年,科学家们利用植物生物反应器生产了100多种重组蛋白,包括：可食用疫苗、抗体和工业酶等；有些产品已经实现了商业化生产,并且创造了良好的经济价值。然而,一些因素诸如产量、品质和同源性等限制了植物生物反应器的广泛应用。增加抗原基因在转基因植株中的表达量是研制安全高效的植物可食用疫苗的关键,而解决的策略集中在启动子的研究。为此本研究选用大豆和苜蓿作为受体植物,在光照和黑暗2种条件下培养,经SDS-PAGE和2D-PAGE分离得到二种苜蓿光照条件高效表达的蛋白质（AL-a和AL-b）和一种大豆黑暗条件高效表达的蛋白质（SN-p）；委托日本BIOSUMS公司进一步测定了AL-a的N-末端7个氨基酸VEVLLGA （Val-Glu-Val-Leu-Leu-Gly-Ala）,并在NCBI数据库中比对查找得到一个最相似的蛋白质-豌豆质体蓝素（plastocyanin of pea, Accession No. X16082）,命名AL-a为苜蓿质体蓝素（alfalfa-plastocyanin, AP）;根据豌豆质体蓝素基因序列设计引物,从苜蓿中PCR扩增苜蓿质体蓝素基因,产物经Applied Biosystems3130Genetic Analyzers自动测序仪测定其DNA序列,对测定结果进行分析显示苜蓿质体蓝素基因包括504bp,并由此DNA序列推出苜蓿质体蓝素的氨基酸序列包括167AA,通过ChloroP软件分析预测此蛋白为叶绿体定位表达（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）。此序列与豌豆质体蓝素基因比对同源性为90%。本研究拟利用植物自身高效表达的特殊蛋白质基因的启动子驱动外源蛋白基因在植物体内同源重组并定点高效表达,从而提高蛋白表达量。植物蛋白质的表达特性直接决定于其启动子的类型。本实验利用RT-PCR法分析苜蓿质体蓝素基因的表达特性,结果表明此蛋白基因启动子既具有组织特异性（只在绿色组织-嫩叶中表达）又具有光诱导特异性（只在光照条件下表达）。根据NCBI数据库中报道的蒺藜苜蓿（Medicago.truncatula）（GenBank:CU013531.5）全基因组序列中质体蓝素编码基因区上游非编码区序列设计引物,以本实验室保存的苜蓿总DNA为模板PCR克隆苜蓿质体蓝素基因启动子序列,经测序后得到含有约400bp的序列（其中包括131bp的编码区和269bp的启动子区P-AP）；应用PlantCARE软件将本实验获得的苜蓿质体蓝素启动子序列与文献报道的豌豆质体蓝素启动子序列（P. sativum petE gene, GenBank:X68313.1）进行比对分析,发现该序列具有启动子核心元件TATA-box、CAAT-box;除此之外,该启动子还包含多个光应答调控元件和叶片特异性元件包括LAMP-element、G-box、Pc-CMA2a、Pc-CMA2b、Pc-CMA2c和GT1-motif等。初步判定此序列为苜蓿质体蓝素基因启动子部分片段。为了研究此序列的表达活性,本试验将此序列置换pBI121质粒中的CaMV35S启动子,驱动其下游的GUS[P-葡糖苷酸酶（β-glucuronidase, GUS）]基因,构建了重组质粒pBI121-P-AP,转化根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens EHA105）后建立植物转化载体,经农杆菌浸种法转染苜蓿,转基因苜蓿经PCR法检测及组织化学检测GUS基因表达,结果显示GUS基因在绿色叶片组织中呈高效表达,在茎组织中基本不表达,初步研究证明启动子的组织特异性表达功能。为利用此启动子驱动人类表皮生长因子受体HER-2基因在转基因苜蓿中高效特异表达生产植物可食抗癌疫苗奠定了基础。
陈苗苗,刘萍,常艳燕,智晓莹,刘学荣,牟克斌,黄银君[3]（2010）在《植物基因工程疫苗研究进展》文中进行了进一步梳理植物基因工程疫苗是利用植物表达重组抗原蛋白来生产疫苗。作者阐述了用转基因植物生产疫苗的基本原理和方法以及植物疫苗的优点,特别是食用疫苗的研究进展及其应用前景。
李传山[4]（2007）在《兔病毒性出血症病毒YL株VP60基因的克隆与生物信息分析及原核表达与转化串叶松香草研究》文中进行了进一步梳理兔出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit Hemorrhagic Disease virus, RHDV）所致的兔的一种急性、高度传染性、高度致死性的疾病,以兔全身实质器官水肿、淤血及出血性变化为主要特征。其发病率和致死率都很高,被感染的成年兔基本上在4872 h内死亡,是兔的一种毁灭性传染病。该病自1984年于中国江苏省首先暴发后迅速流行蔓延开,迄今为止,中国的几乎所有省份都有RHDV流行的报道,在国外各养兔地区也存在和流行,是养兔业的严重威胁。为了研究西北地区的RHDV分子生物学特征和RHDV病毒流行规律,我们应用RT-PCR方法从RHDV西北分离株YL中克隆出衣壳蛋白VP60基因并测序,测序结果显示VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸,序列在GenBank中注册（登录号为DQ530363）。YL株是中国西北地区首株被测序的RHDV。从GenBank里下载全部已发表的其它39株RHDV序列,运用生物信息学软件分析,构建系统进化树和氨基酸序列同源性表,结果表明世界不同地区RHDV分离株基因序列虽然非常保守,达到90 %以上,但可以分为5个基因群,并且基因型和地域性没有必然联系,中国的分离株除了WX84株外,其它均处于第V基因群,该基因群内近年分离出的中国四个不同大地区（西北、华东、东北、西南）的RHDV毒株与NJ85株遗传距离很近,很可能都来自同一毒株NJ85。同时,对四个不同大地区的近年的四个代表性分离株的二级结构、抗原性进行了预测分析,结果显示二级结构有一定差异,但抗原性相同,这与RHDV只有一个血清型相一致。同时为在原核中高效表达兔出血症病毒（RHDV）VP60衣壳蛋白,以研究RHD亚单位疫苗,我们构建了YL株VP60基因原核表达载体VP60-pET32a,转化到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示,VP60融合蛋白分子量为75 kD,其占总菌体蛋白的表达量达39.8 %。Western blot分析表明,VP60融合蛋白可以和RHDV TP株抗血清特异反应。本研究显示兔出血症病毒在干旱半干旱条件下的遗传变异和免疫学特征没有较大变化。我们通过对串叶松香草不同激素浓度配比的诱导分化实验,建立了串叶松香草离体培养高效再生体系,结果表明MS+6-BA（2.0mg/L）+NAA（0.1mg/L）培养基可高效诱导愈伤组织和芽的分化,1/2MS+IBA（0.1mg/L）培养基可快速诱导根的生成,形成再生植株。构建了植物表达载体VP60-pBI121,利用根癌农杆菌介导叶盘法转化串叶松香草以研究高效的串叶松香草转化体系,结果显示以农杆菌LBA4404为介导菌株、以叶片为转化外植体、3 d预培养时间和34 d共培养时间、400 mg/L羧苄青霉素和40 mg/L卡那霉素筛选浓度转化效果较好,在这种转化体系中,我们筛选到了两株VP60拟转基因植株,为利用串叶松香草生产兔出血症病毒动物基因工程疫苗奠定了技术基础
汤昌国,钱栋宇[5]（2006）在《基因工程技术的应用现状》文中研究表明基因工程是通过DNA重组技术,获得具有特殊生物遗传性状和功能的遗传工程生物体。基因工程技术广泛应用于农业、医学,食品工业等。但是这种人为改变生物体遗传特性的生物技术是否能安全地被利用,从而更好地造福人类呢?本文就基因工程的应用现状和存在问题作一综合阐述。
张明洲,应华冠[6]（2005）在《转基因植物生物反应器的研究进展》文中指出叙述了利用转基因植物作为生物反应器生产重组药物蛋白的研究和商业化现状及其发展趋势,并对其表达和纯化策略以及表达效率的提高作了讨论.
周勃[7]（2005）在《用植物表达轮状病毒VP6亚单位食用疫苗的研究》文中指出将轮状病毒（Rotavirus）VP6亚单位基因插入原核表达载体pGEX-KG中,获得了重组质粒pGEX-VP6。经IPTG诱导,在大肠杆菌中高水平表达了GST（谷胱苷肽转移酶）与VP6的融合蛋白。通过GST亲和层析、凝血酶切割和凝胶过滤纯化,获得了高纯度的VP6蛋白。免疫家兔,制备了VP6的高效价特异性多克隆兔抗血清。 以甜菜黑色焦枯病毒（BBSV）侵染性克隆为基础,用经植物偏好型密码子修饰的VP6基因（sVP6）替代BBSV的外壳蛋白（CP）基因。其体外转录产物用于机械接种BBSV的枯斑寄主苋色藜。接种后4-10天,提取发病叶片的总RNA及蛋白,利用RT-PCR或Western blotting方法对sVP6的RNA转录和蛋白表达情况进行检测。在此基础上,利用间接ELISA的方法对不同批次接种叶片中VP6蛋白的表达量进行了测定,数据统计结果表明,发病苋色藜叶片中,VP6蛋白的含量平均值可达植物总可溶性蛋白的0.25%。 分别采集苋色藜健康叶片和接种表达VP6的叶片,粗提取并浓缩叶片中总可溶性蛋白,辅以CpG免疫佐剂灌胃免疫6-8周龄的BALB/c母鼠。初免后的7周中,对小鼠的唾液、粪便及肠道粘膜IgA及血清IgG进行了间接或双抗夹心ELISA的检测。结果表明,与对照组小鼠相比,处理组小鼠无论粘膜IgA还是体液IgG均显示出明显的抗体发生趋势。 用猿轮状病毒SA-11株对受免母鼠所产乳鼠进行攻毒实验,结果表明,在相同的攻毒剂量下,与对照组相比,免疫组母鼠所产小鼠在攻毒后几天中致病率明显下降,腹泻症状较轻且症状持续时间相对缩短。这些研究结果表明,被免疫母鼠体内由VP6亚单位植物食用疫苗所产生的非中和性抗体可以经被动免疫过程传递至子代,并为仔鼠提供异源交叉保护。 同时,成功构建了含轮状病毒VP6亚单位基因的植物双元表达载体pBVP6和pBinBB-sVP6。以分别含有这两种表达载体的农杆菌EHA101进行了甜菜转化,并对甜菜再生苗的外源基因整合情况进行了PCR、PCR-Southern和Southern blotting分析。 以上结果为利用植物作为生物反应器,通过稳定表达或瞬时表达方式生产轮状病毒的可食用疫苗提供了新的技术途径和材料基础。
董江丽[8]（2005）在《利用转基因苜蓿生产轮状病毒可食用疫苗研究》文中认为增加抗原基因在转基因植株中的表达量是研制安全高效的轮状病毒可食用疫苗的关键,为此,我们对人A组轮状病毒VP6基因进行了密码子优化和全人工合成,合成的基因被命名为“sVP6基因”。分别将病毒来源的VP6基因和sVP6基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,获得的重组质粒pGVP6和pGsVP6在大肠杆菌BL21细胞中表达的GST-VP6和GST-sVP6融合蛋白大小一致,均为65kDa;SDS-PAGE结果表明,经谷胱苷肽—琼脂糖树脂层析柱纯化、凝血酶酶切、快速蛋白液相色谱系统分离纯化后获得的sVP6蛋白在变性条件下大小为42kDa,在非变性条件下形成三聚体,大小为130kDa,这一特性和未改造的VP6蛋白相同;Western杂交结果证实单体sVP6蛋白和它的三聚体形式都能够和抗VP6的兔抗血清特异性反应,说明密码子改造的sVP6蛋白和未改造的VP6蛋白在结构和免疫反应性上是一致的。 sVP6基因和病毒来源的VP6基因分别以农杆菌介导法转化烟草（Nicotiana tabacum L）,Western blot分析结果证实,转基因烟草植株表达了sVP6蛋白和VP6蛋白。在sVP6基因转化的烟草叶片中,sVP6蛋白的最高含量达到植物总可溶性蛋白的0.34%,密码子优化使得抗原蛋白的表达量提高了3.8—34倍。 在用模式植物烟草建立了高效表达抗原蛋白的平台的基础上,我们以农杆菌介导法将sVP6基因整合到紫花苜蓿（Medicago sativa L）的基因组中,在转基因苜蓿叶片中,sVP6蛋白的最高含量达到植物总可溶性蛋白的0.28%。 用10mg转基因苜蓿总可溶性蛋白（含有24μg sVP6蛋白）辅以10μg CpG免疫佐剂灌胃免疫6—8周龄的BALB/c母鼠4次,母鼠体内产生了高水平的抗VP6的血清IgG和粘膜IgA抗体。用猿轮状病毒SA-11对免疫后母鼠所生育的乳鼠攻毒,结果表明,与对照组相比,转基因苜蓿免疫的母鼠所生育的乳鼠的腹泻症状明显减轻,腹泻持续时间明显缩短,腹泻比率明显降低,在攻毒后第五天,所有的乳鼠不再腹泻。这些研究结果表明转基因苜蓿表达的轮状病毒VP6抗原免疫母鼠所产生的特异性抗体能够诱导乳鼠产生被动免疫,并为乳鼠提供异源交叉保护。本项研究为利用紫花苜蓿作为生物反应器生产轮状病毒可食用疫苗保护儿童和幼畜免受病毒性腹泻的侵染奠定了基础。
何永睿,陈善春,李红林[9]（2004）在《转基因植物食用疫苗研究进展及其在柑桔育种中的应用》文中进行了进一步梳理
姜健,杨宝灵,李春斌[10]（2004）在《植物基因工程疫苗研究进展》文中提出可口服免疫（oral immunization）绿色疫苗（green vaccine）研究是植物基因工程与分子医学相结合而发展起来的新的研究方向. 对当前植物基因工程疫苗的研究方法、疫苗的作用机理进行介绍,总结近10年来国内外植物基因工程疫苗研究进展,并对未来发展方向作出展望.
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 1 植物口服疫苗的有效性 |
| 2 植物口服疫苗的适用范围 |
| 2.1 病毒性疾病 |
| 2.2 细菌性疾病 |
| 2.3 寄生虫相关疾病 |
| 2.4 肿瘤及肿瘤相关疾病 |
| 2.4.1 肝癌预防 |
| 2.4.2 宫颈癌预防 |
| 3 植物性口服疫苗的研发前景 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转基因植物作为生物反应器生产药用蛋白的研究 |
| 1.1.1 植物生物反应器的概念 |
| 1.1.2 植物生物反应器的优越性 |
| 1.1.3 植物生物反应器在生产药用蛋白的应用 |
| 1.2 利用转基因植物生产可食用疫苗的可行性 |
| 1.2.1 利用转基因植物生产可食用疫苗的优势 |
| 1.2.2 利用转基因植物生产可食用疫苗的植物表达系统 |
| 1.2.3 影响外源蛋白在植物中表达的因素 |
| 1.3 利用转基因植物生产可食用疫苗的问题与展望 |
| 1.4 启动子在转基因植物研究中的应用 |
| 1.4.1 植物启动子的一般结构及功能 |
| 1.4.2 植物启动子的分类 |
| 1.4.3 植物启动子的克隆方法 |
| 1.4.4 启动子在植物基因工程中的应用前景 |
| 1.5 本研究的目的意义 |
| 第二章 苜蓿和大豆高效表达特殊蛋白质及其编码基因的分离与鉴定 |
| 前言 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 植物 |
| 2.1.2 菌种及培养基 |
| 2.1.3 Marker |
| 2.1.4 试剂与药品 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 培养苜蓿和大豆并制备植物蛋白提取液 |
| 2.2.2 SDS-PAGE |
| 2.2.3 2D-PAGE |
| 2.2.4 苜蓿高效表达的特殊蛋白质的氨基酸序列的测定 |
| 2.2.5 苜蓿高效表达的特殊蛋白质基因的核苷酸序列的测定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 苜蓿和大豆的培养及其植物蛋白的提取 |
| 2.3.2 SDS-PAGE分离植物蛋白质 |
| 2.3.3 2D-PAGE分离植物蛋白质 |
| 2.3.4 苜蓿特殊蛋白质的氨基酸序列的测定 |
| 2.3.5 苜蓿特殊蛋白质(AL-a)基因的核苷酸序列的测定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 苜蓿质体蓝素基因启动子表达特性的分析 |
| 前言 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 植物 |
| 3.1.2 试剂和药品 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 苜蓿质体蓝素基因光诱导表达特异性的分析 |
| 3.2.2 苜蓿质体蓝素基因的组织特异性表达分析 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 苜蓿质体蓝素基因的光诱导特异性表达分析 |
| 3.3.2 苜蓿质体蓝素基因的组织特异性表达分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 首蓿质体蓝素基因启动子的克隆分离及重组质粒的构建 |
| 前言 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料和试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法：实验程序图如下 |
| 4.2.1 苜蓿质体蓝素启动子引物的设计 |
| 4.2.2 聚合酶链反应(PCR)提取苜蓿质体蓝素基因启动子 |
| 4.2.3 含有苜蓿质体蓝素基因启动子重组质粒pBI121-P-AP的构建 |
| 4.2.4 重组质粒的扩增 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 PCR法克隆分离苜蓿质体蓝素基因启动子 |
| 4.3.2 苜蓿质体蓝素基因启动子测序结果 |
| 4.3.3 所测得苜蓿质体蓝素启动子序列与NCBI数据库比对结果如下 |
| 4.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测pBI121质粒的酶切结果 |
| 4.3.5 含苜蓿质体蓝素基因启动子P-AP的重组质粒pB121-P-AP的构建 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 转基因首蓿的制备及外源报告基因GUS表达的检测 |
| 前言 |
| 5.1 实验材料和仪器 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 根癌农杆菌菌种的活化 |
| 5.2.2 根癌农杆菌感受态细胞的制备 |
| 5.2.3 重组质粒pBI121-Ap转化根癌农杆菌 |
| 5.2.4 浸种法侵染苜蓿制备转基因苜蓿 |
| 5.2.5 PCR法检测转基因苜蓿 |
| 5.2.6 转基因苜蓿GUS基因表达的组织化学检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 重组质粒转化根癌农杆菌的转化子的筛选 |
| 5.3.2 浸种法转染苜蓿并筛选转基因苜蓿 |
| 5.3.3 PCR法检测转基因苜蓿中的GUS基因 |
| 5.3.4 转基因苜蓿GUS基因表达的组织化学检测 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与讨论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 讨论 |
| 6.2.1 利用苜蓿或大豆作为受体植物生产可食疫苗 |
| 6.2.2 植物特异性启动子提高外源蛋白基因表达量 |
| 6.2.3 转基因苜蓿转化和再生的方法 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表文章 |
| 附件 |
| 学位论文自愿预先检测申请表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 兔出血症病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 兔出血症病毒概述 |
| 1.1.2 兔出血症病毒疫苗的研究进展 |
| 1.1.3 兔出血症病毒疫苗的应用前景 |
| 1.2 植物基因工程疫苗研究进展 |
| 1.2.1 植物基因工程疫苗及可食用疫苗概述 |
| 1.2.2 植物基因工程疫苗的原理及研究进展 |
| 1.2.3 植物基因工程疫苗的优缺点和应对策略及发展前景 |
| 1.3 根癌农杆菌介导的植物遗传转化 |
| 1.3.1 根癌农杆菌介导的遗传转化机制 |
| 1.3.2 根癌农杆菌介导的遗传转化方法 |
| 1.4 串叶松香草研究概况 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 YL 株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆和生物信息分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒材料 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 试剂和仪器 |
| 2.1.4 培养基与溶液 |
| 2.1.5 PCR 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 病毒RNA 的提取 |
| 2.2.3 病毒VP60 基因的反转录(RT)和PCR |
| 2.2.4 RT-PCR 产物的克隆及测序 |
| 2.2.5 VP60 基因的生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 YL 株RHDV 基因组RNA 的提取 |
| 2.3.2 YL 株VP60 基因的扩增 |
| 2.3.3 重组质粒的鉴定 |
| 2.3.4 YL 株VP60 基因的序列测定和编码蛋白分子特征 |
| 2.3.5 RHDV VP60 基因的生物信息分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 兔出血症病毒YL 株衣壳蛋白VP60 基因在原核系统中的高效表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒与菌株 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.1.3 培养基与主要溶液 |
| 3.1.4 PCR 引物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 VP60 基因表达质粒的构建与转化 |
| 3.2.2 VP60 的诱导表达 |
| 3.2.3 重组表达VP60 的SDS-PAGE 检测 |
| 3.2.4 Western blot 检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 原核表达载体VP60-pET32a 的构建 |
| 3.3.2 VP60-pET32a 的鉴定 |
| 3.3.3 VP60 的表达和SDS-PAGE 检测 |
| 3.3.4 重组表达VP60 的Western blot 免疫反应 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 串叶松香草高效再生体系的建立与外壳蛋白基因VP60 的遗传转化 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料及质粒与菌株 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.1.3 培养基与主要溶液 |
| 4.1.4 PCR 引物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 再生体系的建立 |
| 4.2.2 植物表达载体VP60-pBI121 的构建及对农杆菌的转化 |
| 4.2.3 遗传转化体系的建立 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 串叶松香草高频再生培养基的筛选 |
| 4.3.2 植物表达载体VP60-pBI121 的构建 |
| 4.3.3 串叶松香草遗传转化体系的建立 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 引言 |
| 1 基因工程的定义 |
| 2 基因工程的主要研究内容 |
| 3 基因工程的广泛应用 |
| 3.1 在农业上的应用 |
| 3.1.1 抗虫的植物基因工程 |
| 3.1.2 抗除草剂的植物基因工程 |
| 3.1.3 改善植物品质的植物基因工程 |
| 3.1.4 其它一些植物基因工程 |
| 3.1.5 动物转基因育种 |
| 3.2 在医学上的应用 |
| 3.2.1 制药工业的发展 |
| 3.2.2 蛋白质工程的进展 |
| 3.2.3 植物基因工程疫苗研究 |
| 3.2.3. 1 乙型肝炎病毒 |
| 3.2.3. 2 麻疹 |
| 3.2.3. 3 狂犬病病毒 |
| 3.2.3. 4 霍乱 |
| 3.2.3. 5 大肠杆菌 |
| 3.2.3. 6 肝炎C病毒 |
| 3.2.4 基因治疗 |
| 3.2.4. 1 肿瘤基因治疗 |
| 3.2.4. 2 1型糖尿病基因治疗 |
| 4 现存问题 |
| 4.2 植物基因工程的问题 |
| 4.2.1 植物受体材料选择 |
| 4.2.2 食用疫苗的作用机理研究 |
| 4.2.3 外源基因表达的稳定性 |
| 4.3 基因鸿沟 |
| 4.4 基因的平等与保护 |
| 4.5 克隆问题 |
| 5 结论 |
| 1 转基因植物生产药物蛋白的研究进展 |
| 1.1 转基因植物反应器生产药物蛋白研究现状 |
| 1.2 转基因植物生物反应器的优点 |
| 2 转基因植物反应器生产药物蛋白的表达策略及分离纯化策略 |
| 2.1 转基因植物生产药物蛋白的表达策略 |
| 2.2 提高转基因植物药物蛋白的表达效率 |
| 2.3 转基因植物生产药物蛋白的分离纯化策略 |
| 3 转基因植物生产药物蛋白的商业化现状 |
| 4 转基因植物生产药物蛋白存在的问题和发展趋势 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 轮状病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 轮状病毒概述 |
| 1.1.2 轮状病毒疫苗的研究进展 |
| 1.2 植物基因工程疫苗 |
| 1.2.1 植物基因工程疫苗及食用疫苗概述 |
| 1.2.2 植物基因工程疫苗的作用原理及获得方法 |
| 1.2.3 植物基因工程疫苗的优势和局限性 |
| 1.2.4 植物基因工程疫苗的研究进展 |
| 1.3 甜菜再生及转化研究概况 |
| 1.4 甜菜黑色焦枯病毒的研究进展 |
| 1.4.1 甜菜黑色焦枯病毒概述 |
| 1.4.2 甜菜黑色焦枯病毒作为载体在植物中表达外源蛋白的潜力 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 第二章 材料及方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种 |
| 2.1.3 质粒载体 |
| 2.1.4 酶和化学试剂 |
| 2.1.5 引物设计 |
| 2.1.6 培养基和缓冲液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.2.3 单菌落直接鉴定法(Cracking)快速筛选重组质粒 |
| 2.2.4 菌落PCR |
| 2.2.5 质粒DNA的小量提取 |
| 2.2.6 质粒DNA的大量提取 |
| 2.2.7 DNA片段的回收纯化 |
| 2.2.8 目的片段与载体的连接 |
| 2.2.9 质粒载体的酶切和脱盐处理 |
| 2.2.10 体外转录 |
| 2.2.11 RNA摩擦接种 |
| 2.2.12 植物总RNA的提取 |
| 2.2.13 反转录PCR(RT-PCR) |
| 2.2.14 Western blotting |
| 2.2.15 大肠杆菌原核表达载体的诱导表达 |
| 2.2.16 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及染色 |
| 2.2.17 融合蛋白的可溶性分析 |
| 2.2.18 农杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.19 植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.2.20 甜菜基因组总DNA的提取 |
| 2.2.21 基因组PCR |
| 2.2.22 Southern blotting(同位素标记法) |
| 2.2.23 PCR-Southern |
| 第三章 轮状病毒VP6亚单位在大肠杆菌中的诱导表达、纯化及其高效抗血清的制备 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 诱导表达及可溶性分析 |
| 3.2.2 VP6蛋白的纯化 |
| 3.2.3 VP6抗血清的制备 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 原核表达体系的选取 |
| 3.3.2 纯化方法的选取 |
| 3.3.3 兔抗血清制备方法的改进 |
| 第四章 以甜菜黑色焦枯病毒为载体瞬时表达轮状病毒VP6亚单位抗原 |
| 4.1 材料及方法 |
| 4.1.1 ELISA缓冲液的配制 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 瞬时表达载体pBBSV-sVP6的构建 |
| 4.2.2 体外转录和摩擦接种 |
| 4.2.3 发病症状观察 |
| 4.2.4 sVP6基因在苋色藜中表达的分子检测 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 表达VP6的植物叶片饲喂小鼠诱导抗体产生及其免疫保护作用 |
| 5.1 材料及方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 植物接种及叶片收集 |
| 5.2.2 植物材料总可溶性蛋白的提取及定量分析 |
| 5.2.3 小鼠免疫及其体内保护抗体的检测 |
| 5.2.4 攻毒及该食用疫苗为小鼠提供抵抗其他A组轮状病毒的异源交叉保护 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 粘膜免疫的可行性及意义 |
| 5.3.2 轮状病毒VP6亚单位可食用疫苗诱导的被动免疫 |
| 5.3.3 可食用疫苗存在的问题及免疫佐剂 |
| 第六章 农杆菌介导的VP6基因甜菜转化体系的建立 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 甜菜的转化方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 植物表达载体pBinBB-sVP6的构建 |
| 6.2.2 农杆菌介导的甜菜遗传转化 |
| 6.2.3 甜菜再生苗VP6基因整合的分子检测 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 甜菜品种对遗传转化的影响 |
| 6.3.2 转化方法对甜菜遗传转化的影响 |
| 6.3.3 再生抗性植株的生根 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ 调整硫酸铵溶液饱和度计算表(25℃) |
| 附录Ⅱ TRIS-甘氨酸SDS-不连续系统不同浓度凝胶配制用量表 |
| 附录Ⅲ 缩略词 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 植物生物反应器生产可食用疫苗研究进展 |
| 1.1 可食用疫苗的表达系统 |
| 1.2 可食用疫苗的可行性 |
| 1.3 植物生物反应器表达的抗原及其对实验动物的免疫研究进展 |
| 1.4 可食用疫苗的人体临床免疫研究进展 |
| 1.5 增强免疫保护、避免免疫耐受的策略分析 |
| 1.6 问题与展望 |
| 2 轮状病毒疫苗研究进展 |
| 2.1 轮状病毒的结构 |
| 2.2 轮状病毒的致病机制 |
| 2.3 轮状病毒疫苗研究现状 |
| 2.4 轮状病毒疫苗免疫途径 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3.本论文研究的目的意义 |
| 第二章 轮状病毒VP6基因的改造及在大肠杆菌中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 sVP6基因的合成 |
| 2.2 原核表达载体pcVP6、pGsVP6的构建 |
| 2.3 VP6和sVP6蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化 |
| 2.4 用GST-VP6融合蛋白免疫家兔制备抗体 |
| 第三章 VP6基因和改造的sVP6基因在转基因烟草中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 植物转化载体的构建 |
| 2.2 植物表达载体转化根癌农杆菌LBA4404 |
| 2.3 转基因烟草植株的获得 |
| 2.4 转基因烟草的分子检测 |
| 2.5 转基因烟草的Western杂交分析 |
| 2.6 转基因烟草的定量ELISA分析 |
| 第四章 转基因苜蓿表达的轮状病毒疫苗的免疫学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 农杆菌介导的苜蓿遗传转化 |
| 2.2 转基因苜蓿的PCR鉴定 |
| 2.3 转基因苜蓿的PCR-Southern杂交分析 |
| 2.4 转基因苜蓿的RT-PCR鉴定 |
| 2.5 转基因苜蓿的Western杂交分析 |
| 2.6 转基因苜蓿的定量ELISA分析 |
| 2.7 转基因苜蓿的拷贝数分析 |
| 2.8 PCR扩增检测无性扩繁的转基因苜蓿植株 |
| 2.9 转基因苜蓿免疫的小鼠产生的抗体滴度测定76 |
| 2.10 Western杂交检测植物疫苗免疫小鼠后产生的抗体的特异性 |
| 2.11 乳鼠攻毒实验 |
| 第五章 讨论与结论 |
| 1 讨论 |
| 1.1 选择VP6蛋白研制轮状病毒疫苗的可行性 |
| 1.2 转基因植物疫苗与粘膜免疫 |
| 1.3 紫花苜蓿高效表达轮状病毒疫苗 |
| 1.4 CpG ODN作为粘膜免疫佐剂的可行性 |
| 1.5 轮状病毒VP6蛋白诱导被动免疫 |
| 1.6 可食用疫苗发展前景 |
| 2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 1 转基因植物食用疫苗的研究进展 |
| 2 转基因植物食用疫苗的优缺点 |
| 3 转基因植物食用疫苗在柑桔育种中的应用前景 |
| 1 植物基因工程疫苗的生产方法 |
| 1.1 稳定表达系统 |
| 1.2 暂态表达系统 |
| 2 植物基因工程疫苗的作用机理 |
| 3 植物基因工程疫苗的研究现状 |
| 3.1 乙型肝炎病毒 |
| 3.2 麻疹 |
| 3.3 狂犬病病毒 |
| 3.4 霍乱 |
| 3.5 大肠杆菌 |
| 3.6 肝炎C病毒 |
| 3.7 口蹄疫病毒 |
| 4 问题与展望 |
| 4.1 植物受体材料选择 |
| 4.2 食用疫苗的作用机理研究 |
| 4.3 外源基因表达的稳定性 |
